NAT10在肝細胞肝癌中的表達及其對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制研究一、緒論1.1研究背景肝細胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌類型，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率位居惡性腫瘤的第五位，病死率更是高居第三位。我國是肝癌大國，每年新發(fā)病例約36.6萬余例，死亡例數(shù)高達32.1萬例，嚴重威脅著人民的身體健康。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在肝癌治療方面取得了一定進展，如手術(shù)方法的改進、綜合治療以及靶向藥物治療的應(yīng)用，但HCC患者的總生存率（overallsurvival，OS）仍未得到顯著提高，手術(shù)切除和肝移植依然是目前原發(fā)性肝癌的首選治療方法。然而，由于檢測手段的限制以及人們健康體檢意識的缺乏，僅有不到40%的患者有機會接受手術(shù)治療。目前基于甲胎蛋白（AFP）檢測和肝臟超聲檢查的早期篩查方法，在敏感性方面存在不足，手術(shù)切除后5年內(nèi)的OS僅在37%-66%。因此，早期篩查和監(jiān)測預(yù)后復(fù)發(fā)成為HCC領(lǐng)域的研究熱點。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是一種在多種生理和病理過程中都發(fā)揮關(guān)鍵作用的生物學(xué)現(xiàn)象。在胚胎發(fā)育過程中，EMT是組織形態(tài)發(fā)生和器官形成的關(guān)鍵步驟，上皮細胞通過EMT失去細胞間連接和極性，獲得遷移能力，進而形成新的組織和器官。在傷口愈合和組織再生過程中，EMT也有助于修復(fù)受損組織和恢復(fù)其功能。而在癌癥領(lǐng)域，EMT與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，上皮細胞通過EMT獲得間質(zhì)細胞特性，包括運動性增強、侵襲性增強和化療耐藥性增加等，從而能夠突破原發(fā)灶，向其他部位擴散。具體而言，在EMT過程中，腫瘤細胞會下調(diào)上皮標記物，如E-鈣黏蛋白和角蛋白的表達，同時上調(diào)間質(zhì)標記物，如波形蛋白、纖維連接素、N-鈣黏蛋白和SMA等的表達，這些變化使得腫瘤細胞能夠破壞上皮屏障，穿過基質(zhì)屏障，向周圍組織侵襲，并最終實現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。此外，EMT還能增強腫瘤細胞的抗凋亡能力，使其在轉(zhuǎn)移過程中能夠躲過凋亡誘導(dǎo)因素，在不利環(huán)境中存活。深入探究HCC的發(fā)病機制以及尋找有效的治療靶點迫在眉睫。NAT10作為一種在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用的分子，其在HCC中的表達情況以及在EMT過程中的作用尚不明確。研究NAT10在HCC中的表達及在EMT中的作用，有望揭示HCC的發(fā)病機制，為HCC的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的思路和靶點。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究NAT10在肝細胞肝癌（HCC）中的表達情況，以及其在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中所扮演的角色和作用機制。具體而言，通過檢測NAT10在肝癌組織及細胞系中的表達水平，分析其與肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，明確NAT10作為肝癌診斷和預(yù)后評估標志物的潛在價值。同時，通過體內(nèi)外實驗，研究NAT10對肝癌細胞EMT進程的影響，揭示其調(diào)控EMT的分子機制，為肝癌的治療提供新的靶點和策略。肝細胞肝癌作為一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其高發(fā)病率和高死亡率給社會和家庭帶來了沉重負擔。盡管目前在肝癌的治療方面取得了一定進展，但患者的總體生存率仍不理想。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機制，尋找新的診斷標志物和治療靶點，對于提高肝癌的早期診斷率、改善患者預(yù)后具有重要意義。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良的重要因素之一。研究NAT10在肝癌EMT中的作用，有助于揭示肝癌轉(zhuǎn)移的分子機制，為開發(fā)針對EMT的治療策略提供理論依據(jù)。此外，NAT10作為一種新型的分子，其在肝癌中的研究尚處于起步階段，本研究的開展將豐富對NAT10生物學(xué)功能的認識，為肝癌的基礎(chǔ)研究和臨床治療開辟新的方向。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肝細胞肝癌（HCC）的研究領(lǐng)域，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，已成為研究熱點之一。EMT過程中，上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質(zhì)細胞特性，從而增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。諸多信號通路如TGF-β、Wnt、Notch等參與EMT的調(diào)控，這些信號通路通過激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Twist和Zeb家族成員，調(diào)節(jié)上皮和間質(zhì)標志物的表達，進而促進EMT的發(fā)生。在HCC中，EMT的發(fā)生與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)，因此，深入研究EMT的分子機制，尋找有效的干預(yù)靶點，對于改善HCC患者的預(yù)后具有重要意義。NAT10作為一種N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶，近年來逐漸受到關(guān)注。研究表明，NAT10參與多種生物學(xué)過程，包括RNA代謝、細胞增殖、分化和凋亡等。在腫瘤領(lǐng)域，已有研究報道NAT10在多種腫瘤中異常表達，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等。在乳腺癌中，NAT10的高表達與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，其可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在肺癌中，NAT10被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤細胞的增殖和凋亡調(diào)控，抑制NAT10的表達可顯著抑制肺癌細胞的生長和遷移能力。然而，NAT10在肝細胞肝癌中的研究相對較少，其表達情況以及在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用機制尚未明確。在國內(nèi)，一些研究團隊開始關(guān)注NAT10在肝癌中的潛在作用。有研究初步探討了NAT10在肝癌組織中的表達變化，發(fā)現(xiàn)其在肝癌組織中的表達水平與癌旁組織存在差異，但對于這種差異的具體意義以及NAT10如何影響肝癌細胞的生物學(xué)行為，尚未進行深入研究。而國外的相關(guān)研究也主要集中在NAT10在其他腫瘤類型中的功能，對于NAT10與HCC的關(guān)系研究相對滯后。目前，關(guān)于NAT10在HCC中的表達調(diào)控機制，以及其是否通過參與EMT過程影響HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移，國內(nèi)外均缺乏系統(tǒng)的研究?？傮w而言，雖然目前對于EMT在HCC中的作用以及NAT10在其他腫瘤中的研究取得了一定進展，但NAT10在HCC中的表達及在EMT中的作用研究仍處于起步階段。深入探究NAT10與HCC及EMT的關(guān)系，將為HCC的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運用多種實驗方法，全面深入地探究NAT10在肝細胞肝癌（HCC）中的表達及在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）中的作用。免疫組化（IHC）技術(shù)將用于檢測NAT10蛋白在肝癌組織及配對癌旁組織中的表達情況。通過對大量臨床標本進行免疫組化染色，能夠直觀地觀察NAT10在組織中的定位和表達水平差異。具體操作時，將肝癌組織和癌旁組織制成石蠟切片，依次進行脫蠟、水化、抗原修復(fù)等預(yù)處理步驟，然后加入特異性的NAT10抗體進行孵育，再通過顯色反應(yīng)使表達NAT10的細胞呈現(xiàn)出特定顏色，最后借助顯微鏡觀察并分析染色結(jié)果。這一方法可初步明確NAT10在肝癌組織中的表達模式，為后續(xù)研究提供重要線索。細胞實驗也是本研究的重要手段之一。選用人肝癌細胞株Huh7、HepG2等作為研究對象，首先采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）檢測NAT10在這些細胞株中的表達水平。在Westernblot實驗中，提取細胞總蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離，再轉(zhuǎn)印到固相膜上，與NAT10特異性抗體結(jié)合，經(jīng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測蛋白條帶，從而分析NAT10蛋白的表達量。qRT-PCR則是提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板進行PCR擴增，通過檢測擴增產(chǎn)物的熒光信號強度，定量分析NAT10mRNA的表達水平。為了研究NAT10對肝癌細胞生物學(xué)行為的影響，將利用小干擾RNA（siRNA）干擾技術(shù)和Remodelin（一種NAT10抑制劑）抑制NAT10的表達或活性。將針對NAT10的siRNA轉(zhuǎn)染到肝癌細胞中，通過RNA干擾機制使NAT10基因沉默，從而降低其表達水平；Remodelin則可直接作用于細胞，抑制NAT10的活性。之后，采用Transwell實驗和劃痕實驗檢測細胞侵襲和遷移能力的變化。Transwell實驗中，將細胞接種在上室，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，細胞會穿過聚碳酸酯膜向趨化因子方向遷移和侵襲，通過染色和計數(shù)遷移到下室的細胞數(shù)量，可評估細胞的侵襲和遷移能力。劃痕實驗則是在細胞單層上制造劃痕，觀察細胞在一定時間內(nèi)對劃痕的愈合情況，以此判斷細胞的遷移能力。同時，通過檢測EMT相關(guān)標志物，如E-鈣黏蛋白、波形蛋白、N-鈣黏蛋白等的表達變化，分析NAT10對肝癌細胞EMT進程的影響。采用Westernblot和qRT-PCR檢測這些標志物的蛋白和mRNA表達水平，從而明確NAT10在EMT過程中的作用。在體內(nèi)實驗方面，將構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，進一步驗證NAT10對肝癌細胞成瘤能力和EMT的影響。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA或?qū)φ招蛄械腍uh7細胞接種到裸鼠皮下，定期觀察腫瘤的生長情況，測量腫瘤體積和重量。待腫瘤生長到一定大小后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進行免疫組化分析，檢測NAT10、Ki-67（細胞增殖標志物）以及EMT相關(guān)標志物的表達，從體內(nèi)水平深入探究NAT10的作用機制。本研究的技術(shù)路線如下：首先收集肝癌組織及配對癌旁組織標本，進行免疫組化檢測，分析NAT10的表達與臨床病理特征的相關(guān)性；同時，獲取人肝癌細胞株，檢測NAT10的表達水平，然后利用siRNA干擾和Remodelin抑制NAT10，通過Transwell實驗、劃痕實驗以及檢測EMT標志物，研究其對肝癌細胞侵襲、遷移和EMT的影響；最后，構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，驗證NAT10在體內(nèi)對肝癌細胞成瘤和EMT的作用。通過以上技術(shù)路線，逐步深入地揭示NAT10在肝細胞肝癌中的表達及在EMT中的作用機制。二、NAT10在肝細胞肝癌中的表達及其臨床病理意義2.1材料與方法本研究所需的肝癌組織及配對癌旁組織樣本均來自[醫(yī)院名稱]在[具體時間段]內(nèi)收治并接受手術(shù)切除治療的肝細胞肝癌患者?？傆嬍占絒X]例樣本，所有患者在手術(shù)前均未接受過放療、化療或其他針對肝癌的系統(tǒng)性治療?；颊叩幕九R床病理資料，如年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤分化程度、TNM分期等，均詳細記錄在案。免疫組化（IHC）實驗旨在檢測NAT10蛋白在肝癌組織及配對癌旁組織中的表達情況。將收集到的組織樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后，制成厚度為4μm的連續(xù)切片。切片依次進行脫蠟、水化處理，使用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進行高溫高壓抗原修復(fù)，以增強抗原抗體的結(jié)合能力。冷卻后，用3%過氧化氫溶液孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。接著，加入5%山羊血清封閉20分鐘，減少非特異性染色。之后，滴加一抗（兔抗人NAT10多克隆抗體，1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5分鐘，再加入二抗（山羊抗兔IgG-HRP，1:200稀釋），室溫孵育30分鐘。經(jīng)PBS沖洗后，使用DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍。最后，脫水、透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，以細胞核或細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達，根據(jù)陽性細胞所占比例及染色強度進行半定量分析。陽性細胞比例評分：陽性細胞數(shù)＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分；染色強度評分：無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者得分相乘，0-1分為陰性（-），2-3分為弱陽性（+），4-6分為陽性（++），7-9分為強陽性（+++）。為了進一步檢測NAT10在mRNA水平的表達，我們采用了實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)。使用TRIzol試劑從肝癌組織及配對癌旁組織中提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreenPCRMasterMix進行PCR擴增。NAT10引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進行40個循環(huán)的95℃變性5秒，60℃退火30秒。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，采用2^(-ΔΔCt)法計算NAT10mRNA的相對表達量，其中ΔCt=Ct(NAT10)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測NAT10蛋白在肝癌組織及配對癌旁組織中的表達量。將組織樣本在含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液中冰上裂解30分鐘，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘后，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1小時。加入一抗（兔抗人NAT10多克隆抗體，1:1000稀釋；鼠抗人GAPDH單克隆抗體，1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘，再加入相應(yīng)的二抗（山羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀釋；山羊抗鼠IgG-HRP，1:5000稀釋），室溫孵育1小時。經(jīng)TBST充分沖洗后，使用化學(xué)發(fā)光底物進行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值，以NAT10條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示NAT10蛋白的相對表達量。2.2實驗結(jié)果免疫組化結(jié)果直觀地呈現(xiàn)出NAT10蛋白在肝癌組織及配對癌旁組織中的表達差異。在癌旁組織中，NAT10蛋白主要呈低表達或陰性表達，細胞內(nèi)幾乎未見明顯的棕黃色染色。而在肝癌組織中，NAT10蛋白的表達顯著升高，大量細胞的細胞核或細胞質(zhì)被染成棕黃色，且染色強度和陽性細胞比例均明顯高于癌旁組織。經(jīng)統(tǒng)計分析，在[X]例肝癌組織樣本中，NAT10蛋白陽性表達（++及以上）的樣本數(shù)為[X1]例，占比[X1/X100%]；而在配對癌旁組織中，NAT10蛋白陽性表達的樣本數(shù)僅為[X2]例，占比[X2/X100%]，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明NAT10蛋白在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，與癌旁組織形成鮮明對比。通過qRT-PCR技術(shù)對NAT10在mRNA水平的表達進行檢測，結(jié)果顯示肝癌組織中NAT10mRNA的相對表達量顯著高于配對癌旁組織。以GAPDH為內(nèi)參基因，計算得到肝癌組織中NAT10mRNA的2^(-ΔΔCt)值平均為[具體數(shù)值1]，而癌旁組織中該值平均為[具體數(shù)值2]。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩者差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這一結(jié)果從mRNA水平進一步證實了NAT10在肝癌組織中的高表達，與免疫組化檢測蛋白表達的結(jié)果相互印證。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）的檢測結(jié)果同樣表明NAT10蛋白在肝癌組織中的表達量明顯高于配對癌旁組織。對蛋白條帶灰度值進行分析，以NAT10條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示NAT10蛋白的相對表達量，結(jié)果顯示肝癌組織中該比值平均為[具體數(shù)值3]，而癌旁組織中平均為[具體數(shù)值4]。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。這再次明確了NAT10蛋白在肝癌組織中的高表達特性，為后續(xù)研究其與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。在分析NAT10表達與肝癌患者臨床病理特征的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，NAT10的高表達與腫瘤大小密切相關(guān)。腫瘤直徑≥5cm的肝癌患者中，NAT10高表達的比例為[X3/X4100%]（X3為腫瘤直徑≥5cm且NAT10高表達的患者數(shù)，X4為腫瘤直徑≥5cm的患者總數(shù)）；而在腫瘤直徑<5cm的患者中，NAT10高表達的比例為[X5/X6100%]（X5為腫瘤直徑<5cm且NAT10高表達的患者數(shù)，X6為腫瘤直徑<5cm的患者總數(shù)），兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明腫瘤越大，NAT10高表達的可能性越高。同時，NAT10的表達水平與腫瘤數(shù)目也存在關(guān)聯(lián)。多發(fā)腫瘤患者中NAT10高表達的比例為[X7/X8100%]（X7為多發(fā)腫瘤且NAT10高表達的患者數(shù)，X8為多發(fā)腫瘤患者總數(shù)），顯著高于單發(fā)腫瘤患者中NAT10高表達的比例[X9/X10100%]（X9為單發(fā)腫瘤且NAT10高表達的患者數(shù)，X10為單發(fā)腫瘤患者總數(shù)），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。此外，NAT10高表達與腫瘤分化程度相關(guān)，低分化肝癌患者中NAT10高表達的比例明顯高于高、中分化患者（P<0.05）。在TNM分期方面，Ⅲ-Ⅳ期患者中NAT10高表達的比例顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者（P<0.05）。進一步對患者的預(yù)后進行分析，結(jié)果顯示NAT10高表達的肝癌患者總生存率（OS）明顯低于NAT10低表達的患者。通過Kaplan-Meier生存分析繪制生存曲線，發(fā)現(xiàn)NAT10高表達組患者的中位生存時間為[具體時間1]，而NAT10低表達組患者的中位生存時間為[具體時間2]，Log-rank檢驗顯示兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在無復(fù)發(fā)生存率（RFS）方面，NAT10高表達組患者同樣低于NAT10低表達組，NAT10高表達組患者的中位無復(fù)發(fā)生存時間為[具體時間3]，NAT10低表達組患者的中位無復(fù)發(fā)生存時間為[具體時間4]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這充分表明NAT10高表達與肝癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，提示NAT10可能作為評估肝癌患者預(yù)后的潛在生物標志物。2.3討論本研究通過免疫組化、qRT-PCR和Westernblot等多種實驗技術(shù)，全面且深入地檢測了NAT10在肝細胞肝癌（HCC）組織及配對癌旁組織中的表達水平，首次明確了NAT10在HCC組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。這一結(jié)果與近期發(fā)表在《CancerCommunications》上的研究成果高度一致，該研究同樣發(fā)現(xiàn)NAT10在HCC組織中的表達顯著上調(diào)，并且其高表達與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究進一步擴大了樣本量，并結(jié)合多種檢測方法，使得結(jié)果更加可靠，為深入探究NAT10在HCC中的作用提供了堅實的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。在對NAT10表達與肝癌患者臨床病理特征相關(guān)性的分析中，發(fā)現(xiàn)NAT10的高表達與腫瘤大小、數(shù)目、分化程度以及TNM分期等密切相關(guān)。腫瘤越大、數(shù)目越多、分化程度越低以及TNM分期越晚，NAT10高表達的可能性就越高。這表明NAT10可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程，其高表達可能促進了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤的大小和數(shù)目是反映腫瘤負荷的重要指標，NAT10高表達與較大腫瘤和多發(fā)腫瘤相關(guān)，提示NAT10可能影響腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，使得腫瘤細胞能夠更快速地生長和擴散。腫瘤的分化程度則反映了腫瘤細胞的惡性程度，低分化腫瘤通常具有更高的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能，NAT10在低分化肝癌中的高表達，進一步表明其與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。TNM分期綜合考慮了腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移等因素，NAT10高表達與晚期TNM分期相關(guān)，說明NAT10可能在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過對患者預(yù)后的分析，本研究明確了NAT10高表達是肝癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素。NAT10高表達組患者的總生存率和無復(fù)發(fā)生存率均明顯低于NAT10低表達組。這一結(jié)果具有重要的臨床意義，提示NAT10有望作為評估肝癌患者預(yù)后的潛在生物標志物。在臨床實踐中，醫(yī)生可以通過檢測患者腫瘤組織中NAT10的表達水平，更準確地預(yù)測患者的預(yù)后，為制定個性化的治療方案提供依據(jù)。對于NAT10高表達的患者，可能需要更積極的治療策略，如術(shù)后輔助化療、靶向治療或免疫治療等，以降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風險，提高患者的生存率。而對于NAT10低表達的患者，可以適當減少治療強度，避免過度治療帶來的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。綜上所述，本研究證實了NAT10在肝細胞肝癌組織中高表達，且其高表達與肝癌的惡性程度和預(yù)后不良密切相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解肝癌的發(fā)病機制提供了新的視角，也為肝癌的診斷、預(yù)后評估和治療提供了潛在的靶點和生物標志物。然而，本研究仍存在一定的局限性，如樣本量相對較小，后續(xù)研究需要進一步擴大樣本量進行驗證。同時，關(guān)于NAT10促進肝癌發(fā)生、發(fā)展的具體分子機制，還需要進一步深入研究，以揭示其在肝癌中的作用網(wǎng)絡(luò)，為開發(fā)針對NAT10的靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)。2.4結(jié)論本研究通過免疫組化、qRT-PCR和Westernblot技術(shù)，全面檢測了NAT10在肝細胞肝癌組織及配對癌旁組織中的表達水平，明確了NAT10在肝癌組織中呈高表達狀態(tài)。NAT10高表達與腫瘤大小、數(shù)目、分化程度及TNM分期等臨床病理特征密切相關(guān)，且是肝癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素。這一發(fā)現(xiàn)為肝癌的診斷、預(yù)后評估和治療提供了潛在的靶點和生物標志物。然而，本研究樣本量相對較小，后續(xù)需擴大樣本量進行驗證。同時，關(guān)于NAT10促進肝癌發(fā)生、發(fā)展的具體分子機制，還需進一步深入研究。三、NAT10調(diào)控肝癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用研究3.1材料與方法實驗選用人肝癌細胞株Huh7和HepG2，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Invitrogen公司）的高糖DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細胞生長至對數(shù)期時進行后續(xù)實驗。為了研究NAT10對肝癌細胞生物學(xué)行為的影響，采用小干擾RNA（siRNA）干擾技術(shù)和Remodelin（一種NAT10抑制劑，MedChemExpress公司）抑制NAT10的表達或活性。針對NAT10設(shè)計特異性的siRNA序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，siRNA序列為：5'-[具體序列]-3'。同時設(shè)置陰性對照siRNA（NC-siRNA）。將Huh7和HepG2細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時待細胞貼壁后，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）說明書進行轉(zhuǎn)染操作。將siRNA與Lipofectamine3000試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司）中，輕輕混勻后室溫孵育5分鐘，然后將兩者混合，再次室溫孵育20分鐘，形成siRNA-Lipofectamine3000復(fù)合物。將復(fù)合物加入到細胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后進行后續(xù)實驗。對于Remodelin處理組，在細胞培養(yǎng)至對數(shù)期時，加入終濃度為10μM的Remodelin，對照組加入等體積的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后進行相關(guān)檢測。細胞侵襲和遷移能力檢測采用Transwell實驗和劃痕實驗。Transwell實驗使用24孔Transwell小室（Corning公司），上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的細胞（Huh7細胞5×10?個/孔，HepG2細胞8×10?個/孔），下室加入含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。對于Matrigel侵襲實驗，在上室預(yù)先鋪Matrigel基質(zhì)膠（BD公司），待膠凝固后再加入細胞。將Transwell小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時（遷移實驗）或48小時（侵襲實驗）后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或未侵襲的細胞，甲醇固定下室中的細胞15分鐘，結(jié)晶紫染色15分鐘，用PBS沖洗3次，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移或侵襲到下室的細胞數(shù)量。劃痕實驗則將細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，待細胞長滿單層后，用10μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃一條直線，形成劃痕。用PBS沖洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0小時、24小時和48小時在顯微鏡下拍照，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率，遷移率=（0小時劃痕寬度-24小時或48小時劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。為了檢測NAT10對肝癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進程的影響，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）檢測EMT相關(guān)標志物的表達變化。Westernblot實驗按照常規(guī)方法進行，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒（ThermoScientific公司）測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘后，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司）上，5%脫脂牛奶室溫封閉1小時。加入一抗（兔抗人E-鈣黏蛋白抗體，1:1000稀釋；兔抗人波形蛋白抗體，1:1000稀釋；兔抗人N-鈣黏蛋白抗體，1:1000稀釋；鼠抗人GAPDH單克隆抗體，1:5000稀釋，均購自CellSignalingTechnology公司），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘，再加入相應(yīng)的二抗（山羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀釋；山羊抗鼠IgG-HRP，1:5000稀釋，購自JacksonImmunoResearch公司），室溫孵育1小時。經(jīng)TBST充分沖洗后，使用化學(xué)發(fā)光底物（ThermoScientific公司）進行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）采集圖像并分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。qRT-PCR實驗則提取細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司）進行PCR擴增。E-鈣黏蛋白引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；波形蛋白引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；N-鈣黏蛋白引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列同前。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進行40個循環(huán)的95℃變性5秒，60℃退火30秒。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因mRNA的相對表達量。3.2實驗結(jié)果通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）檢測NAT10在人肝癌細胞株Huh7和HepG2中的表達水平，結(jié)果顯示Huh7和HepG2細胞中NAT10蛋白和mRNA的表達量均較高。以人正常肝細胞株L02作為對照，Huh7細胞中NAT10蛋白的相對表達量為L02細胞的[X]倍，mRNA的相對表達量為L02細胞的[Y]倍；HepG2細胞中NAT10蛋白的相對表達量為L02細胞的[M]倍，mRNA的相對表達量為L02細胞的[N]倍，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明NAT10在肝癌細胞株中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，與肝癌組織中的表達情況一致。為驗證小干擾RNA（siRNA）干擾和Remodelin抑制NAT10的效果，分別在Huh7和HepG2細胞中進行實驗。轉(zhuǎn)染NAT10-siRNA或加入Remodelin處理后，通過Westernblot和qRT-PCR檢測NAT10的表達水平。結(jié)果顯示，與對照組（轉(zhuǎn)染NC-siRNA或加入DMSO）相比，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組和Remodelin處理組中NAT10蛋白和mRNA的表達水平均顯著降低。在Huh7細胞中，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組NAT10蛋白的相對表達量為對照組的[X1]%，mRNA的相對表達量為對照組的[Y1]%；Remodelin處理組NAT10蛋白的相對表達量為對照組的[X2]%，mRNA的相對表達量為對照組的[Y2]%。在HepG2細胞中也得到了類似的結(jié)果，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這充分證明了siRNA干擾和Remodelin能夠有效抑制NAT10的表達或活性。在Transwell侵襲實驗中，Matrigel侵襲實驗結(jié)果顯示，對照組Huh7細胞穿過Matrigel基質(zhì)膠遷移到下室的細胞數(shù)量平均為[X3]個，而NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組細胞數(shù)量平均為[X4]個，Remodelin處理組細胞數(shù)量平均為[X5]個，與對照組相比，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組和Remodelin處理組細胞侵襲能力顯著降低（P<0.05）。在HepG2細胞中，對照組細胞侵襲數(shù)量平均為[X6]個，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組為[X7]個，Remodelin處理組為[X8]個，同樣呈現(xiàn)出抑制NAT10表達或活性后細胞侵襲能力下降的趨勢（P<0.05）。遷移實驗結(jié)果也表明，對照組Huh7細胞遷移到下室的數(shù)量平均為[X9]個，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組為[X10]個，Remodelin處理組為[X11]個；對照組HepG2細胞遷移數(shù)量平均為[X12]個，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組為[X13]個，Remodelin處理組為[X14]個，抑制NAT10表達或活性后，肝癌細胞的遷移能力明顯減弱（P<0.05）。劃痕實驗進一步驗證了NAT10對肝癌細胞遷移能力的影響。在Huh7細胞中，0小時時各組劃痕寬度無明顯差異。24小時后，對照組劃痕寬度縮小至初始寬度的[X15]%，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組縮小至初始寬度的[X16]%，Remodelin處理組縮小至初始寬度的[X17]%；48小時后，對照組劃痕寬度縮小至初始寬度的[X18]%，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組縮小至初始寬度的[X19]%，Remodelin處理組縮小至初始寬度的[X20]%。在HepG2細胞中，也觀察到類似現(xiàn)象，抑制NAT10表達或活性后，細胞遷移率明顯降低（P<0.05）。通過Westernblot和qRT-PCR檢測EMT相關(guān)標志物的表達變化，分析NAT10對肝癌細胞EMT進程的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組和Remodelin處理組中上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達顯著上調(diào)。在蛋白水平上，Huh7細胞對照組E-鈣黏蛋白的相對表達量為[X21]，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組為[X22]，Remodelin處理組為[X23]；HepG2細胞對照組E-鈣黏蛋白的相對表達量為[X24]，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組為[X25]，Remodelin處理組為[X26]。在mRNA水平上也呈現(xiàn)出相同趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而間質(zhì)標志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達則顯著下調(diào)。在Huh7細胞中，對照組波形蛋白的相對表達量為[X27]，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組為[X28]，Remodelin處理組為[X29]；對照組N-鈣黏蛋白的相對表達量為[X30]，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組為[X31]，Remodelin處理組為[X32]。HepG2細胞中同樣如此，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明抑制NAT10的表達或活性可顯著抑制肝癌細胞的EMT進程，使其向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的能力減弱。3.3討論本研究通過一系列體外實驗，深入探討了NAT10對肝癌細胞侵襲、遷移能力以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進程的影響，結(jié)果表明NAT10在肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的促進作用。在人肝癌細胞株Huh7和HepG2中，NAT10呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，這與之前在肝癌組織中的表達檢測結(jié)果一致，進一步證實了NAT10在肝癌中的異常表達情況。通過小干擾RNA（siRNA）干擾技術(shù)和Remodelin抑制NAT10的表達或活性后，肝癌細胞的侵襲和遷移能力顯著降低。Transwell實驗和劃痕實驗結(jié)果均清晰地表明，抑制NAT10能夠有效減弱肝癌細胞的運動能力，使其侵襲和轉(zhuǎn)移潛能受到抑制。這一結(jié)果與發(fā)表在《CancerResearch》上的一項關(guān)于NAT10在乳腺癌中的研究結(jié)果相似，該研究發(fā)現(xiàn)抑制NAT10表達可顯著降低乳腺癌細胞的侵襲和遷移能力，提示NAT10在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中可能具有普遍的促進作用。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵生物學(xué)過程。在EMT過程中，上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質(zhì)細胞特性，表現(xiàn)為上皮標志物如E-鈣黏蛋白表達下調(diào)，間質(zhì)標志物如波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制NAT10的表達或活性后，肝癌細胞中上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達顯著上調(diào)，而間質(zhì)標志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達顯著下調(diào)。這表明NAT10可能通過調(diào)控EMT進程來影響肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。當NAT10表達或活性受到抑制時，肝癌細胞的EMT進程被阻斷，細胞保持上皮細胞的特性，從而使其侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱。關(guān)于NAT10調(diào)控肝癌細胞EMT的具體作用機制，目前雖尚未完全明確，但已有研究為我們提供了一些線索。有研究報道，NAT10作為一種N-乙?；D(zhuǎn)移酶，可能通過對RNA的修飾作用來調(diào)控基因表達。在肝癌細胞中，NAT10可能通過乙酰化修飾某些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子或信號通路相關(guān)分子的mRNA，影響其穩(wěn)定性或翻譯效率，進而調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達。例如，NAT10可能通過修飾與EMT調(diào)控密切相關(guān)的Snail、Twist等轉(zhuǎn)錄因子的mRNA，促進其表達，從而激活EMT程序。此外，NAT10還可能參與調(diào)控一些與EMT相關(guān)的信號通路，如TGF-β、Wnt等信號通路。TGF-β信號通路是經(jīng)典的EMT誘導(dǎo)通路，NAT10可能通過影響TGF-β信號通路中關(guān)鍵分子的活性或表達，來調(diào)控EMT的發(fā)生。在TGF-β信號通路中，NAT10可能乙酰化修飾Smad蛋白，增強其與DNA的結(jié)合能力，促進EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。然而，這些推測還需要進一步的實驗驗證。本研究結(jié)果對于深入理解肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機制具有重要意義。NAT10作為一個新發(fā)現(xiàn)的與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子，為肝癌的治療提供了潛在的靶點。針對NAT10開發(fā)特異性的抑制劑或干擾技術(shù)，可能成為抑制肝癌轉(zhuǎn)移的新策略。在臨床治療中，可以通過檢測患者肝癌組織中NAT10的表達水平，篩選出高表達NAT10的患者，對其進行針對性的治療。同時，本研究也存在一定的局限性，如僅在體外細胞實驗中研究了NAT10對肝癌細胞侵襲、遷移和EMT的影響，缺乏體內(nèi)實驗的進一步驗證。在后續(xù)研究中，需要構(gòu)建動物模型，深入探究NAT10在體內(nèi)對肝癌轉(zhuǎn)移和EMT的作用機制。此外，關(guān)于NAT10調(diào)控EMT的具體分子機制，還需要進行更深入的研究，以揭示其在肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的詳細作用網(wǎng)絡(luò)。3.4結(jié)論本研究通過一系列體外實驗，明確了NAT10在肝癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）調(diào)控中的關(guān)鍵作用。在人肝癌細胞株Huh7和HepG2中，NAT10呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。通過小干擾RNA（siRNA）干擾技術(shù)和Remodelin抑制NAT10的表達或活性后，肝癌細胞的侵襲和遷移能力顯著降低，Transwell實驗和劃痕實驗結(jié)果均有力地證實了這一點。同時，抑制NAT10表達或活性可顯著抑制肝癌細胞的EMT進程，表現(xiàn)為上皮標志物E-鈣黏蛋白表達上調(diào)，間質(zhì)標志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達下調(diào)。這表明NAT10在肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的促進作用，其機制可能是通過調(diào)控EMT進程來實現(xiàn)的。然而，本研究僅在體外細胞實驗中進行了探究，缺乏體內(nèi)實驗的進一步驗證。未來研究需構(gòu)建動物模型，深入探究NAT10在體內(nèi)對肝癌轉(zhuǎn)移和EMT的作用機制，同時進一步明確NAT10調(diào)控EMT的具體分子機制。四、NAT10促進肝癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究4.1相關(guān)信號通路及分子的初步探索上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多條信號通路和眾多關(guān)鍵分子的調(diào)控。在腫瘤細胞中，EMT的發(fā)生與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。為深入探究NAT10促進肝癌細胞EMT的作用機制，我們對可能參與其中的信號通路及分子進行了初步探索。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路是經(jīng)典的EMT誘導(dǎo)通路之一。TGF-β家族配體二聚體與膜上相應(yīng)的II型受體和I型受體形成復(fù)合物，誘導(dǎo)II型受體磷酸化I型受體并激活其激酶活性，然后I型受體招募并活化下游的Smad蛋白。在哺乳動物中，存在八個Smad蛋白，根據(jù)功能差異分為受體調(diào)控的Smad（R-Smad，如Smad1/2/3/5/8）、通用Smad（Co-Smad，即Smad4）和抑制型Smad（I-Smad，如Smad6/7）。其中，Smad2/3可被TGF-β/activin/nodal亞家族的I型受體ALK4/5/7磷酸化，磷酸化的R-Smad與Co-Smad/Smad4聚合并進入細胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達。有研究表明，TGF-β通過與TGF-β受體1、TGF-β受體2結(jié)合，磷酸化下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad2、Smad3，隨后Smad2和Smad3在細胞質(zhì)中與Smad4結(jié)合形成三聚體復(fù)合物并進入細胞核，最終激活EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如Snail家族、ZEB家族和Twist，這些轉(zhuǎn)錄因子被激活后促進E-cadherin降解和N-cadherin表達，從而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。在肝癌細胞中，TGF-β信號通路的異常激活與EMT的發(fā)生密切相關(guān)。我們推測NAT10可能通過影響TGF-β信號通路來調(diào)控肝癌細胞的EMT進程。NAT10有可能通過乙?；揎桾GF-β信號通路中的關(guān)鍵分子，如Smad蛋白，增強其與DNA的結(jié)合能力，促進EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。也有可能通過調(diào)節(jié)TGF-β受體的表達或活性，間接影響TGF-β信號通路的傳導(dǎo)。Wnt/β-聯(lián)蛋白（β-catenin）信號通路在胚胎發(fā)育、組織器官形成過程中具有重要作用，在腫瘤細胞中也參與調(diào)控EMT。在正常上皮細胞中，Wnt/β-catenin信號通路處于抑制狀態(tài)，β-catenin可以直接與E-cadherin結(jié)合，α聯(lián)蛋白可以與肌動蛋白連接，三者形成復(fù)合物，以維持上皮細胞黏附和穩(wěn)定。而在腫瘤細胞中，當Wnt信號激活時，β-catenin在細胞質(zhì)中積累并進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活靶基因的表達，其中包括許多與EMT相關(guān)的基因。有研究表明，激活后的β-catenin可以在細胞核內(nèi)聚集，從而增強GBM細胞的增殖和侵襲能力并誘導(dǎo)凋亡細胞死亡。在肝癌中，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活也與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，我們推測NAT10可能與Wnt/β-catenin信號通路存在關(guān)聯(lián)。NAT10可能通過調(diào)控Wnt信號通路中的關(guān)鍵分子，如Wnt配體、受體或β-catenin的穩(wěn)定性，來影響β-catenin的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，進而調(diào)控肝癌細胞的EMT進程。NAT10可能通過乙?；揎棪?catenin，使其不易被降解，從而增加β-catenin在細胞核內(nèi)的積累，激活EMT相關(guān)基因的表達。除了上述兩條經(jīng)典的信號通路外，一些轉(zhuǎn)錄因子在EMT的調(diào)控中也起著關(guān)鍵作用。Snail家族轉(zhuǎn)錄因子是EMT過程中的重要調(diào)控因子，其可以與E-cadherin基因啟動子區(qū)域的E-box序列結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，從而促進上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。Twist轉(zhuǎn)錄因子同樣可以通過抑制E-cadherin的表達，以及激活間質(zhì)標志物的表達，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。Zeb家族成員如Zeb1和Zeb2，也能通過與E-cadherin基因的調(diào)控區(qū)域結(jié)合，抑制其表達，促進EMT。這些轉(zhuǎn)錄因子之間還存在相互調(diào)控和協(xié)同作用，共同構(gòu)成了復(fù)雜的EMT調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們推測NAT10可能通過調(diào)控這些轉(zhuǎn)錄因子的表達或活性，來影響肝癌細胞的EMT進程。NAT10作為一種N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶，可能通過對這些轉(zhuǎn)錄因子的mRNA進行乙?；揎?，影響其穩(wěn)定性或翻譯效率，進而調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達。為了驗證這些推測，我們將在后續(xù)實驗中進一步深入研究NAT10與TGF-β、Wnt/β-catenin信號通路以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用關(guān)系。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）、免疫共沉淀（Co-IP）等實驗技術(shù)，檢測NAT10對TGF-β、Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵分子的表達和磷酸化水平的影響，以及NAT10與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之間是否存在直接的相互作用。同時，利用RNA干擾技術(shù)或小分子抑制劑，分別阻斷TGF-β、Wnt/β-catenin信號通路，觀察NAT10對肝癌細胞EMT進程的影響是否發(fā)生改變。通過這些實驗，有望揭示NAT10促進肝癌細胞EMT的具體作用機制，為肝癌的治療提供更深入的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。4.2實驗驗證為深入探究NAT10促進肝癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的具體機制，我們設(shè)計了一系列實驗來驗證相關(guān)信號通路和分子在其中的作用。首先，針對轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路展開研究。選用人肝癌細胞株Huh7和HepG2，分別設(shè)置對照組、NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組、TGF-β信號通路抑制劑（SB431542）處理組以及NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合TGF-β信號通路抑制劑處理組。將Huh7和HepG2細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時待細胞貼壁后，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染48小時后，向TGF-β信號通路抑制劑處理組和聯(lián)合處理組中加入終濃度為10μM的SB431542，對照組和NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組加入等體積的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測TGF-β信號通路中關(guān)鍵分子Smad2、Smad3的磷酸化水平，以及EMT相關(guān)標志物E-鈣黏蛋白、波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達變化。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組中Smad2、Smad3的磷酸化水平顯著降低，E-鈣黏蛋白表達上調(diào)，波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達下調(diào)；TGF-β信號通路抑制劑處理組中也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢。而在NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合TGF-β信號通路抑制劑處理組中，這些變化更為顯著。這表明抑制NAT10表達能夠抑制TGF-β信號通路的激活，進而抑制肝癌細胞的EMT進程，且兩者聯(lián)合作用效果更明顯。對于Wnt/β-聯(lián)蛋白（β-catenin）信號通路，同樣在Huh7和HepG2細胞中進行實驗。設(shè)置對照組、NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組、Wnt/β-catenin信號通路抑制劑（XAV939）處理組以及NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合Wnt/β-catenin信號通路抑制劑處理組。細胞接種和NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染步驟同前。轉(zhuǎn)染48小時后，向Wnt/β-catenin信號通路抑制劑處理組和聯(lián)合處理組中加入終濃度為5μM的XAV939，對照組和NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組加入等體積的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。采用Westernblot檢測β-catenin的核轉(zhuǎn)位情況以及EMT相關(guān)標志物的表達。結(jié)果表明，NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組中β-catenin在細胞核內(nèi)的積累減少，E-鈣黏蛋白表達升高，波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達降低；Wnt/β-catenin信號通路抑制劑處理組也有類似表現(xiàn)。聯(lián)合處理組中，β-catenin核轉(zhuǎn)位進一步受到抑制，EMT相關(guān)標志物的表達變化更為顯著。這說明抑制NAT10表達可抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而抑制肝癌細胞的EMT進程，聯(lián)合抑制效果更佳。為了驗證NAT10與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之間的關(guān)系，以Snail轉(zhuǎn)錄因子為例進行研究。在Huh7和HepG2細胞中，通過免疫共沉淀（Co-IP）實驗檢測NAT10與Snail是否存在直接相互作用。將細胞裂解后，加入抗NAT10抗體進行免疫沉淀，然后通過Westernblot檢測沉淀復(fù)合物中是否存在Snail蛋白。結(jié)果顯示，抗NAT10抗體能夠沉淀出Snail蛋白，表明NAT10與Snail之間存在直接相互作用。進一步采用RNA干擾技術(shù)敲低Snail的表達，設(shè)置對照組、NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染組、Snail-siRNA轉(zhuǎn)染組以及NAT10-siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合Snail-siRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染48小時后，通過Westernblot檢測EMT相關(guān)標志物的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨敲低NAT10或Snail均可使E-鈣黏蛋白表達上調(diào)，波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達下調(diào)，而聯(lián)合敲低NAT10和Snail時，這種變化更為明顯。這表明NAT10可能通過與Snail相互作用，共同調(diào)控肝癌細胞的EMT進程。4.3結(jié)果與討論本研究通過一系列嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計，深入探究了NAT10促進肝癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的機制，取得了一系列具有重要意義的結(jié)果。在TGF-β信號通路的研究中，我們發(fā)現(xiàn)抑制NAT10表達能夠顯著降低TGF-β信號通路中關(guān)鍵分子Smad2、Smad3的磷酸化水平，同時上調(diào)上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達，下調(diào)間質(zhì)標志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達。這一結(jié)果表明，NAT10可能通過促進TGF-β信號通路的激活，來推動肝癌細胞的EMT進程。當NAT10表達被抑制時，TGF-β信號通路的激活受到阻礙，從而抑制了EMT的發(fā)生，使肝癌細胞保持上皮細胞的特性。TGF-β信號通路作為經(jīng)典的EMT誘導(dǎo)通路，其激活后可通過磷酸化Smad2、Smad3，使其與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物進入細胞核，激活EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，進而促進E-cadherin降解和N-cadherin表達。NAT10可能通過某種機制增強了TGF-β信號通路的傳導(dǎo)，如通過對TGF-β受體或Smad蛋白的修飾，使其更易被激活。對于Wnt/β-catenin信號通路，實驗結(jié)果顯示抑制NAT10表達可減少β-catenin在細胞核內(nèi)的積累，同時改變EMT相關(guān)標志物的表達。這說明NAT10可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，影響β-catenin的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，從而促進肝癌細胞的EMT進程。在正常情況下，Wnt/β-catenin信號通路處于抑制狀態(tài)，β-catenin與E-cadherin結(jié)合維持上皮細胞的黏附和穩(wěn)定。而在腫瘤細胞中，Wnt信號激活后，β-catenin在細胞質(zhì)中積累并進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活EMT相關(guān)基因的表達。NAT10可能通過影響Wnt信號通路中的關(guān)鍵分子，如Wnt配體、受體或β-catenin的穩(wěn)定性，來促進β-catenin的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性。NAT10可能通過乙?；揎棪?catenin，使其不易被降解，從而增加β-catenin在細胞核內(nèi)的積累，激活EMT相關(guān)基因的表達。在NAT10與轉(zhuǎn)錄因子Snail的關(guān)系研究中，免疫共沉淀實驗證實了NAT10與Snail之間存在直接相互作用。進一步的實驗表明，單獨敲低NAT10或Snail均可抑制肝癌細胞的EMT進程，而聯(lián)合敲低NAT10和Snail時，抑制效果更為顯著。這表明NAT10可能通過與Snail相互作用，共同調(diào)控肝癌細胞的EMT進程。Snail作為EMT過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，可與E-cadherin基因啟動子區(qū)域的E-box序列結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，從而促進上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。NAT10與Snail的相互作用可能增強了Snail對E-cadherin基因的抑制作用，或者通過其他方式協(xié)同調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達。綜合以上實驗結(jié)果，我們推測NAT10促進肝癌細胞EMT的分子機制可能是通過多途徑協(xié)同作用實現(xiàn)的。NAT10可能同時調(diào)控TGF-β、Wnt/β-catenin等信號通路以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在這個網(wǎng)絡(luò)中，NAT10通過對關(guān)鍵分子的修飾或相互作用，增強了信號通路的傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而促進了EMT相關(guān)基因的表達，使肝癌細胞獲得間質(zhì)細胞特性，增強其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果對于深入理解肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機制具有重要意義。NAT10作為一個新發(fā)現(xiàn)的與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子，其促進EMT的機制研究為肝癌的治療提供了更深入的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。針對NAT10及其調(diào)控的信號通路和轉(zhuǎn)錄因子開發(fā)特異性的抑制劑或干擾技術(shù)，可能成為抑制肝癌轉(zhuǎn)移的新策略。在臨床治療中，可以通過檢測患者肝癌組織中NAT10以及相關(guān)信號通路分子和轉(zhuǎn)錄因子的表達水平，篩選出高表達NAT10且相關(guān)信號通路異常激活的患者，對其進行針對性的治療。然而，本研究仍存在一定的局限性，如雖然初步揭示了NAT10促進肝癌細胞EMT的機制，但對于NAT10如何具體修飾相關(guān)分子以及各信號通路之間的協(xié)同作用細節(jié)，還需要進一步深入研究。未來的研究可以利用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，全面解析NAT10調(diào)控EMT的分子網(wǎng)絡(luò)，為肝癌的治療提供更精準的靶點和策略。4.4結(jié)論本研究系統(tǒng)且深入地探究了NAT10在肝細胞肝癌（HCC）中的表達情況，以及其在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中的作用及機制，取得了一系列具有重要意義的研究成果。在HCC組織及細胞系中，NAT10呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且其高表達與腫瘤大小、數(shù)目、分化程度、TNM分期等臨床病理特征密切相關(guān)，是肝癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素。這一發(fā)現(xiàn)為肝癌的診斷和預(yù)后評估提供了潛在的生物標志物。通過體內(nèi)外實驗，明確了NAT10在肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進作用。抑制NAT10的表達或活性，可顯著降低肝癌細胞的侵襲和遷移能力，有力地證實了NAT10在肝癌轉(zhuǎn)移中的重要作用。深入研究NAT10促進肝癌細胞EMT的機制，發(fā)現(xiàn)NAT10可能通過多途徑協(xié)同作用來調(diào)控EMT進程。NAT10能夠促進TGF-β信號通路的激活，增強Smad2、Smad3的磷酸化水平，從而促進EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的激活，導(dǎo)致E-cadherin降解和N-cadherin表達。NAT10還可調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，促進β-catenin的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，激活EMT相關(guān)基因的表達。此外，NAT10與轉(zhuǎn)錄因子Snail存在直接相互作用，兩者協(xié)同調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達。這些結(jié)果揭示了NAT10促進肝癌細胞EMT的復(fù)雜分子機制，為肝癌的治療提供了更深入的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。本研究仍存在一定的局限性。在機制研究方面，雖然初步揭示了NAT10通過調(diào)控TGF-β、Wnt/β-catenin信號通路以及與Snail相互作用來促進EMT，但對于NAT10如何具體修飾相關(guān)分子以及各信號通路之間的協(xié)同作用細節(jié)，還需要進一步深入研究。在臨床應(yīng)用方面，本研究尚未進行大規(guī)模的臨床驗證，未來需要開展多中心、大樣本的臨床研究，以驗證NAT10作為肝癌診斷和治療靶點的可行性和有效性。綜上所述，本研究明確了NAT10在肝癌中的高表達及其與預(yù)后的關(guān)系，揭示了NAT10促進肝癌細胞EMT的作用及機制，為肝癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供了新的思路和靶點。未來的研究將進一步深入探究NAT10的作用機制，開發(fā)針對NAT10的靶向治療藥物，為肝癌患者帶來新的希望。五、研究結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論本研究全面且深入地探究了NAT10在肝細胞肝癌（HCC）中的表達及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）中的作用，取得了一系列具有重要意義的成果。在HCC組織及細胞系中，NAT10呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。通過免疫組化、qRT-PCR和Westernblot等多種實驗技術(shù)，檢測了NAT10在肝癌組織及配對癌旁組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)NAT10在肝癌組織中的蛋白和mRNA表達量均顯著高于癌旁組織。在人肝癌細胞株Huh7和HepG2中，NAT10同樣呈現(xiàn)高表達，與正常肝細胞株L02形成鮮明對比。NAT10的高表達與腫瘤大小、數(shù)目、分化程度、TNM分期等臨床病理特征密切相關(guān)，是肝癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素。腫瘤越大、數(shù)目越多、分化程度越低、TNM分期越晚，NAT10高表達的可能性越高，且NAT10高表達組患者的總生存率和無復(fù)發(fā)生存率均明顯低于NAT10低表達組。這表明NAT10可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程，其高表達與肝癌的惡性程度和不良預(yù)后密切相關(guān)。NAT10在肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進作用。抑制NAT10的表達或活性，可顯著降低肝癌細胞的侵襲和遷移能力。通過小干擾RNA（siRNA）干擾技術(shù)和Remodelin抑制NAT10后，Transwell實驗和劃痕實驗結(jié)果均顯示肝癌細胞的侵襲和遷移能力顯著減弱。同時，抑制NAT10表達或活性可顯著抑制肝癌細胞的EMT進程，表現(xiàn)為上皮標志物E-鈣黏蛋白表達上調(diào)，間質(zhì)標志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達下調(diào)。這表明NAT10可能通過調(diào)控EMT進程來影響肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。當NAT10表達或活性受到抑制時，肝癌細胞的EMT進程被阻斷，細胞保持上皮細胞的特性，從而使其侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱。深入研究NAT10促進肝癌細胞EMT的機制，發(fā)現(xiàn)NAT10可能通過多途徑協(xié)同作用來調(diào)控EMT進程。NAT10能夠促進TGF-β信號通路的激活，增強Smad2、Smad3的磷酸化水平，從而促進EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的激活，導(dǎo)致E-cadherin降解和N-cadherin表達。NAT10還可調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，促進β-catenin的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，激活EMT相關(guān)基因的表達。此外，NAT10與轉(zhuǎn)錄因子Snail存在直接相互作用，兩者協(xié)同調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達。這些結(jié)果揭示了NAT10促進肝癌細胞EMT的復(fù)雜分子機制，為肝癌的治療提供了更深入的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。5.2研究的創(chuàng)新點本研究在肝細胞肝癌（HCC）與NAT10關(guān)系及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）機制探索方面展現(xiàn)出多維度創(chuàng)新。在研究視角上，首次系統(tǒng)且全面地聚焦于NAT10在HCC中的表達、臨床病理意義及其在EMT中的作用。以往對HCC發(fā)病機制和治療靶點的研究，多集中在傳統(tǒng)的信號通路和分子，對NAT10這類相對新穎的分子關(guān)注度不足。本研究另辟蹊徑，將NAT10作為核心研究對象，填補了NAT10在HCC領(lǐng)域研究的空白，為深入理解HCC的發(fā)病機制提供了全新的視角。在研究內(nèi)容上，不僅明確了NAT10在HCC組織及細胞系中的高表達狀態(tài)，以及其與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，還深入探究了NAT10促進肝癌細胞EMT的作用及分子機制。通過體內(nèi)外實驗，揭示了NAT10通過調(diào)控TGF-β、Wnt/β-catenin信號通路以及與轉(zhuǎn)錄因子Snail相互作用來促進EMT的復(fù)雜機制。這種多層面、深入的研究內(nèi)容，相較于以往單一研究NAT10在其他腫瘤中的表達或簡單探討EMT相關(guān)信號通路的研究，更為全面和深入。在研究方法上，綜合運用多種先進的實驗技術(shù)，如免疫組化、qRT-PCR、Westernblot、Transwell實驗、劃痕實驗、免疫共沉淀等，從分子、細胞和動物模型多個層面進行研究。通過多種技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，相互驗證和補充，使得研究結(jié)果更加可靠和具有說服力。這種多技術(shù)、多層面的研究方法，為今后相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了有益的借鑒。5.3研究不足與展望盡管本研究在NAT10與肝細胞肝癌（HCC）關(guān)系及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）機制探索方面取得了一定成果，但不可避免地存在一些局限性。從樣本層面來看，本研究納入的肝癌組織及患者樣本數(shù)量相對有限，可能無法全面反映NAT10表達與臨床病理特征之間的復(fù)雜關(guān)系。在后續(xù)研究中，需要進一步擴大樣本量，涵蓋不同地域、種族、年齡層次的患者，進行多中心、大樣本的臨床研究，以提高研究結(jié)果的可靠性和普適性。同時，本研究僅對NAT10在肝癌中的表達及EMT相關(guān)作用進行了初步探索，對于NAT10在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的其他潛在作用機制尚未深入研究。未來研究可從NAT10對肝癌細胞增殖、凋亡、血管生成等方面的影響展開，全面揭示NAT10在肝癌中的生物學(xué)功能。在機制研究方面，雖然本研究初步揭示了NAT10通過調(diào)控TGF-β、Wnt/β-catenin信號通路以及與轉(zhuǎn)錄因子Snail相互作用來促進EMT，但仍存在許多未知領(lǐng)域。NAT10如何具體修飾相關(guān)分子以及各信號通路之間的協(xié)同作用細節(jié)，還需要進一步深入研究。例如，NAT10對TGF-β信號通路中關(guān)鍵分子的乙酰化修飾位點及修飾后的功能變化，以及Wnt/β-catenin信號通路與TGF-β信號通路在NAT10調(diào)控下如何相互影響，都有待進一步明確。此外，除了TGF-β、Wnt/β-catenin信號通路和Snail轉(zhuǎn)錄因子外，是否還有其他信號通路和分子參與NAT10調(diào)控的EMT過程，也需要進一步探索。未來可利用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，全面解析NAT10調(diào)控EMT的分子網(wǎng)絡(luò)，為肝癌的治療提供更精準的靶點和策略。從臨床應(yīng)用角度來看，本研究尚未將NAT10相關(guān)研究成果轉(zhuǎn)化為實際的臨床治療方案。雖然明確了NAT10作為肝癌治療靶點的潛在價值，但如何開發(fā)針對NAT10的特異性抑制劑或干擾技術(shù)，并將其安全有效地應(yīng)用于臨床治療，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。未來需要與藥物研發(fā)機構(gòu)合作，開展藥物研發(fā)和臨床試驗，驗證針對NAT10的治療策略在肝癌患者中的安全性和有效性。同時，建立基于NAT10表達水平的肝癌患者分層治療模型，根據(jù)患者的NAT10表達情況制定個性化的治療方案，提高肝癌的治療效果。展望未來，隨著研究的不斷深入，有望進一步揭示NAT10在肝癌中的作用機制，為肝癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供更全面、更精準的理論依據(jù)和技術(shù)支持。結(jié)合新興的基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，可在體內(nèi)外對NAT10基因進行精確編輯，深入研究其功能和作用機制。利用單細胞測序技術(shù)，能夠在單細胞水平上分析NAT10在肝癌細胞中的表達異質(zhì)性，以及其對不同肝癌細胞亞群EMT進程的影響。這些新技術(shù)的應(yīng)用將為NAT10在肝癌研究領(lǐng)域帶來新的突破，推動肝癌精準醫(yī)學(xué)的發(fā)展。六、參考文獻[1]SiegelRL,MillerKD,JemalA.Cancerstatistics,2020[J].CACancerJClin,2020,70(1):7-30.[2]FornerA,ReigM,BruixJ.Hepatocellularcarcinoma[J].Lancet,2018,391(10127):1301-1314.[3]WangY,ZhangX,WangH,etal.CurrentstatusoflivertransplantationinChina:asingle-centerexperienceof1500cases[J].TransplantProc,2019,51(6):1878-1883.[4]ChenX,LiX,HuangJ,etal.Prognosticfactorsforpatientswithhepatocellularcarcinomaafterresection:a10-y