LRP6在心力衰竭進(jìn)程中的角色與分子機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義心力衰竭（HeartFailure，HF），簡(jiǎn)稱(chēng)心衰，是各種心臟疾病的嚴(yán)重階段和終末階段，近年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有2600萬(wàn)人患有心力衰竭，且每年新增病例數(shù)不斷增加。在中國(guó)，隨著人口老齡化的加劇以及心血管疾病患病率的上升，心力衰竭的患者數(shù)量也日益龐大，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。心力衰竭的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)失衡、心肌重構(gòu)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等多個(gè)方面。神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)失衡主要表現(xiàn)為交感神經(jīng)系統(tǒng)激活和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）激活，導(dǎo)致心臟負(fù)荷增加、心肌損傷和利尿鈉排泄障礙，進(jìn)而加劇心衰癥狀。心肌重構(gòu)包括心肌肥厚、心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡等過(guò)程，過(guò)度的心臟重塑會(huì)導(dǎo)致心臟功能進(jìn)一步惡化。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激也在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等以及活性氧（ROS）和氧化氮（NO）等氧化劑，會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和心肌纖維化，加重心衰病情。目前，臨床上針對(duì)心力衰竭的治療主要包括藥物治療、器械治療和心臟移植等。藥物治療是基礎(chǔ)，常用藥物有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）、β受體阻滯劑、利尿劑和醛固酮拮抗劑等，這些藥物在一定程度上可以改善患者的癥狀和預(yù)后，但無(wú)法完全阻止心力衰竭的進(jìn)展，部分患者對(duì)藥物治療反應(yīng)不佳，且長(zhǎng)期使用藥物可能會(huì)產(chǎn)生各種不良反應(yīng)。器械治療如心臟再同步化治療（CRT）和植入式心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器（ICD），雖能改善部分患者的心功能和降低心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，但存在嚴(yán)格的適應(yīng)證限制，且費(fèi)用較高。心臟移植是終末期心力衰竭最有效的治療方法，但由于供體短缺、免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題，其應(yīng)用受到極大限制。因此，深入研究心力衰竭的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)策略，對(duì)于提高心力衰竭的治療效果、改善患者的生活質(zhì)量和預(yù)后具有重要意義。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6（LRP6）作為一種單跨膜蛋白，在經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。既往研究表明，LRP6在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、遷移和分化等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在心血管系統(tǒng)中，LRP6參與了心臟的發(fā)育和心肌細(xì)胞的增殖調(diào)控。小鼠Lrp6的消融會(huì)影響心臟祖細(xì)胞的增殖和存活，并在早期心臟發(fā)生過(guò)程中造成一系列嚴(yán)重的形態(tài)發(fā)生缺陷。成年后，LRP6功能障礙與冠心病和致命性心律失常有關(guān)。然而，目前關(guān)于LRP6在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用及機(jī)制尚未完全明確。本研究聚焦于LRP6在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及其機(jī)制，旨在通過(guò)深入探究LRP6與心力衰竭相關(guān)信號(hào)通路的相互作用，揭示LRP6在心力衰竭中的潛在調(diào)控機(jī)制，為心力衰竭的防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。這不僅有助于深化對(duì)心力衰竭發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，推動(dòng)心血管疾病領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究發(fā)展，還可能為開(kāi)發(fā)新型的心力衰竭治療藥物和干預(yù)策略提供新的方向，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2LRP6概述LRP6基因編碼低密度脂蛋白（LDL）受體基因家族的一個(gè)成員，LRP6作為一種單跨膜蛋白，是Wnt信號(hào)通路的共受體，與Frizzled共同起始Wnt經(jīng)典信號(hào)通路。Wnt配體與受體結(jié)合誘導(dǎo)的LRP6-Frizzled復(fù)合體的形成是Wnt/β-catenin通路激活所必需的。LRP6的結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特，其N(xiāo)端位于細(xì)胞外，包含多個(gè)富含半胱氨酸的重復(fù)序列（CRR）和表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列（EGF-like），這些結(jié)構(gòu)域在與Wnt配體及其他蛋白的相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CRR結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合Wnt配體，從而啟動(dòng)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。EGF-like結(jié)構(gòu)域則可能參與調(diào)節(jié)LRP6的構(gòu)象變化，增強(qiáng)其與其他分子的結(jié)合親和力。LRP6的跨膜區(qū)由一段疏水氨基酸序列組成，負(fù)責(zé)將LRP6錨定在細(xì)胞膜上，維持其在細(xì)胞表面的穩(wěn)定存在。LRP6的C端位于細(xì)胞內(nèi)，包含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在Wnt信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。當(dāng)LRP6與Wnt配體結(jié)合后，C端的磷酸化位點(diǎn)會(huì)被一系列激酶磷酸化，進(jìn)而招募下游的信號(hào)分子，激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路。在經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)中，LRP6起著不可或缺的關(guān)鍵作用。當(dāng)Wnt配體存在時(shí)，它首先與細(xì)胞膜上的Frizzled受體結(jié)合，然后招募LRP6，形成Wnt-Frizzled-LRP6三元復(fù)合物。這一復(fù)合物的形成會(huì)引發(fā)LRP6的磷酸化，具體過(guò)程為：LRP6的C端被酪蛋白激酶1（CK1）和糖原合成酶激酶3β（GSK3β）磷酸化，磷酸化后的LRP6會(huì)招募一種名為Dishevelled（Dvl）的蛋白。Dvl蛋白是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它的招募會(huì)進(jìn)一步激活下游的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Dvl會(huì)抑制GSK3β的活性，從而阻止β-catenin的磷酸化和降解。在正常情況下，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中會(huì)被GSK3β磷酸化，然后被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。而當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活后，β-catenin得以穩(wěn)定積累，并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)，這些靶基因參與細(xì)胞增殖、分化、遷移等多種生物學(xué)過(guò)程。既往研究表明，LRP6參與了胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、遷移和分化等多個(gè)重要的生理過(guò)程。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，LRP6對(duì)于心臟、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼等器官和組織的正常發(fā)育至關(guān)重要。例如，小鼠Lrp6的消融會(huì)影響心臟祖細(xì)胞的增殖和存活，并在早期心臟發(fā)生過(guò)程中造成一系列嚴(yán)重的形態(tài)發(fā)生缺陷，導(dǎo)致心臟發(fā)育異常。在細(xì)胞增殖方面，LRP6通過(guò)激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞遷移過(guò)程中，LRP6可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，影響細(xì)胞的遷移能力。在細(xì)胞分化方面，LRP6參與調(diào)控多種細(xì)胞類(lèi)型的分化，如神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化、間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等的分化等。同時(shí)，LRP6功能異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在心血管系統(tǒng)疾病中，成年后LRP6功能障礙與冠心病和致命性心律失常有關(guān)。在腫瘤領(lǐng)域，LRP6的異常激活或過(guò)表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等。在這些癌癥中，LRP6通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而推動(dòng)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，LRP6的功能異常也可能參與了阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過(guò)程，其具體機(jī)制可能與LRP6在神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化、存活以及神經(jīng)遞質(zhì)代謝等方面的作用有關(guān)。1.3心力衰竭發(fā)病機(jī)制簡(jiǎn)述心力衰竭的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，涉及多個(gè)層面和多種因素，是多種病理生理過(guò)程相互作用的結(jié)果。其常見(jiàn)病因主要包括心肌病變、心臟負(fù)荷過(guò)重以及心室前負(fù)荷不足等。心肌病變是引發(fā)心力衰竭的重要原因之一，常見(jiàn)的心肌病變類(lèi)型多樣，如心肌缺血，這多由冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈狹窄或阻塞，使心肌血液供應(yīng)不足，心肌細(xì)胞因缺血缺氧而受損，影響心臟的正常收縮和舒張功能；心肌炎則是由病毒、細(xì)菌等病原體感染或自身免疫反應(yīng)等引起的心肌炎癥，炎癥會(huì)損傷心肌細(xì)胞，破壞心肌的正常結(jié)構(gòu)和功能；甲狀腺功能亢進(jìn)時(shí)，甲狀腺激素分泌過(guò)多，會(huì)加速心肌代謝，增加心臟負(fù)擔(dān)，長(zhǎng)期可導(dǎo)致心肌肥厚和心功能減退。心臟負(fù)荷過(guò)重同樣在心力衰竭的發(fā)病中扮演關(guān)鍵角色。壓力負(fù)荷過(guò)重常見(jiàn)于高血壓、主動(dòng)脈瓣狹窄、肺動(dòng)脈高壓等疾病。以高血壓為例，血壓長(zhǎng)期升高會(huì)使心臟射血時(shí)面臨的阻力增大，心臟為了克服這種阻力，心肌會(huì)逐漸肥厚，初期心臟可通過(guò)這種代償機(jī)制維持正常功能，但長(zhǎng)期過(guò)度的壓力負(fù)荷會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變，最終引發(fā)心力衰竭。容量負(fù)荷過(guò)重常見(jiàn)于心臟瓣膜關(guān)閉不全，如二尖瓣關(guān)閉不全、主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全等，血液反流使心臟在舒張期需要容納過(guò)多的血液，導(dǎo)致心臟容量負(fù)荷增加，心臟逐漸擴(kuò)大，心功能受損。心室前負(fù)荷不足也可導(dǎo)致心力衰竭，二尖瓣狹窄時(shí)，左心房血液流入左心室受阻，左心室充盈不足，心輸出量減少，為了維持正常的心輸出量，心臟會(huì)通過(guò)代償機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)，但長(zhǎng)期可導(dǎo)致心臟功能失代償，引發(fā)心力衰竭；縮窄性心包炎時(shí)，心包的纖維化和增厚限制了心臟的舒張，使心室充盈受限，同樣會(huì)導(dǎo)致心功能下降。在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，心室重塑是一個(gè)核心的病理生理過(guò)程。心室重塑是指心臟在長(zhǎng)期的壓力或容量負(fù)荷增加、心肌損傷等刺激下，心臟的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生的一系列適應(yīng)性改變，包括心肌肥厚、心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡等。心肌肥厚是心室重塑的早期表現(xiàn)，當(dāng)心臟受到長(zhǎng)期的負(fù)荷增加刺激時(shí)，心肌細(xì)胞會(huì)通過(guò)增加蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞體積增大來(lái)進(jìn)行代償，以維持心臟的泵血功能。然而，過(guò)度的心肌肥厚會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體數(shù)量相對(duì)減少，能量代謝異常，心肌細(xì)胞的順應(yīng)性降低，影響心臟的舒張功能。同時(shí)，肥厚的心肌組織需氧量增加，而冠狀動(dòng)脈的供血能力卻不能相應(yīng)提高，導(dǎo)致心肌缺血，進(jìn)一步加重心肌損傷。心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化是心室重塑的另一個(gè)重要特征，其主要表現(xiàn)為心肌間質(zhì)中膠原纖維過(guò)度沉積。這一過(guò)程受到多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的調(diào)控，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路在心肌纖維化中起著關(guān)鍵作用。TGF-β可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成，抑制膠原蛋白降解，導(dǎo)致膠原纖維在心肌間質(zhì)中大量堆積。心肌纖維化會(huì)使心肌僵硬度增加，心臟的舒張功能受損，同時(shí)也會(huì)影響心肌細(xì)胞之間的電傳導(dǎo)和機(jī)械協(xié)調(diào)性，增加心律失常的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。心肌細(xì)胞凋亡也是心室重塑的重要組成部分，在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，多種因素如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)失衡等都可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量減少，心臟收縮功能下降，心輸出量進(jìn)一步降低。同時(shí)，心肌細(xì)胞凋亡還會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)和纖維化，進(jìn)一步加重心室重塑和心功能惡化。除了上述因素外，神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)失衡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等也在心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)失衡主要表現(xiàn)為交感神經(jīng)系統(tǒng)激活和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）激活。交感神經(jīng)系統(tǒng)激活會(huì)使心率加快、心肌收縮力增強(qiáng)，短期內(nèi)可維持心臟的泵血功能，但長(zhǎng)期過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致心肌耗氧量增加、心肌細(xì)胞凋亡和心律失常等。RAAS激活會(huì)使血管緊張素Ⅱ和醛固酮分泌增加，導(dǎo)致血管收縮、水鈉潴留，增加心臟的前后負(fù)荷，同時(shí)還會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大和纖維化。炎癥反應(yīng)在心衰發(fā)病中扮演重要角色，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和心肌纖維化，加重心衰病情。氧化應(yīng)激是心衰發(fā)病的重要原因之一，活性氧（ROS）和氧化氮（NO）等氧化劑會(huì)損傷心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能障礙和凋亡，促進(jìn)心室重塑。1.4研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探討LRP6在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及其潛在機(jī)制，具體研究目的如下：明確LRP6在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)變化：通過(guò)建立壓力超負(fù)荷介導(dǎo)的心力衰竭動(dòng)物模型以及細(xì)胞模型，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和免疫組織化學(xué)等方法，檢測(cè)不同階段心力衰竭模型中LRP6在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化，分析LRP6表達(dá)與心力衰竭病情進(jìn)展的相關(guān)性。揭示LRP6參與壓力超負(fù)荷介導(dǎo)的心肌肥厚機(jī)制：在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中，通過(guò)基因敲低或過(guò)表達(dá)技術(shù)改變LRP6的表達(dá)水平，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)、大小以及相關(guān)肥厚標(biāo)志物的變化。運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)方法，深入研究LRP6對(duì)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路以及其他相關(guān)信號(hào)通路（如MAPK信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路等）的調(diào)控作用，明確LRP6在心肌肥厚過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。探究Tamoxifen誘導(dǎo)的心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠出現(xiàn)心力衰竭表型的機(jī)制：構(gòu)建Tamoxifen誘導(dǎo)的心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠模型，觀察小鼠的心功能指標(biāo)（如心臟射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率等）、心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化。從細(xì)胞凋亡、心肌纖維化、能量代謝等多個(gè)角度，研究LRP6缺失導(dǎo)致心力衰竭的潛在機(jī)制，分析LRP6在維持心肌正常功能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中的關(guān)鍵作用。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：研究視角創(chuàng)新：以往關(guān)于LRP6的研究主要集中在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等領(lǐng)域，在心血管系統(tǒng)中，雖然已知LRP6參與心臟發(fā)育和心肌細(xì)胞增殖調(diào)控，但對(duì)于其在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及機(jī)制研究相對(duì)較少。本研究從心力衰竭這一全新視角出發(fā)，深入探究LRP6在該疾病中的作用及分子機(jī)制，有望為心力衰竭的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路和方向。研究方法創(chuàng)新：綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和模型，包括基因編輯技術(shù)構(gòu)建心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠模型、壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭動(dòng)物模型和細(xì)胞模型，以及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和影像學(xué)等多學(xué)科研究方法，從整體動(dòng)物水平、組織器官水平、細(xì)胞水平和分子水平全方位揭示LRP6在心力衰竭中的作用機(jī)制，使研究結(jié)果更加全面、深入和準(zhǔn)確。潛在應(yīng)用創(chuàng)新：本研究成果可能為心力衰竭的防治提供新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)策略。若能明確LRP6在心力衰竭中的關(guān)鍵作用及機(jī)制，有望通過(guò)調(diào)控LRP6的表達(dá)或活性，開(kāi)發(fā)新型的治療藥物或治療方法，為心力衰竭患者帶來(lái)新的希望，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和潛在的社會(huì)效益。二、LRP6與心力衰竭的關(guān)聯(lián)研究2.1LRP6在心力衰竭患者中的表達(dá)特征2.1.1臨床樣本采集與分析本研究選取了[具體時(shí)間段]在[具體醫(yī)院名稱(chēng)]心內(nèi)科住院且經(jīng)臨床確診為心力衰竭的患者[X]例作為病例組，同時(shí)選取了同期在該醫(yī)院進(jìn)行健康體檢、年齡和性別相匹配的[X]名健康者作為對(duì)照組。心力衰竭的診斷依據(jù)為符合[具體的心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)，如《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南》的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)]，患者均有典型的心力衰竭癥狀（如呼吸困難、乏力、水腫等），結(jié)合心電圖、超聲心動(dòng)圖等檢查結(jié)果綜合判斷。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：近期（3個(gè)月內(nèi)）有急性心肌梗死、感染性心內(nèi)膜炎、惡性腫瘤等疾?。桓文I功能?chē)?yán)重障礙；自身免疫性疾?。唤谑褂眠^(guò)影響LRP6表達(dá)或Wnt信號(hào)通路的藥物等。在征得所有研究對(duì)象的知情同意后，于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集肘靜脈血5mL，置于含有抗凝劑（EDTA-K2）的采血管中，輕輕顛倒混勻，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，分離出血漿，將血漿分裝后保存于-80℃冰箱待測(cè)。同時(shí)，采集部分患者的心肌組織樣本，這些樣本來(lái)源于因心臟疾病接受心臟手術(shù)（如冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、心臟瓣膜置換術(shù)等）的患者，在手術(shù)過(guò)程中，于心臟病變部位（對(duì)于心力衰竭患者，主要采集左心室心肌組織）切取約0.5g的心肌組織，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。對(duì)于健康對(duì)照組，由于無(wú)法獲取心肌組織，我們參考以往相關(guān)研究中正常心肌組織的LRP6表達(dá)數(shù)據(jù)作為對(duì)照。為了分析LRP6的表達(dá)水平，我們運(yùn)用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。首先，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)血漿和心肌組織中LRP6mRNA的表達(dá)水平。具體步驟如下：使用TRIzol試劑（Invitrogen公司）提取血漿和心肌組織中的總RNA，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，確保RNA的純度和完整性。通過(guò)測(cè)定260nm和280nm處的吸光度值（A260/A280）來(lái)評(píng)估RNA的純度，理想的A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系和條件嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，LRP6引物序列為：上游引物5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物5'-[具體堿基序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物5'-[具體堿基序列]-3'。反應(yīng)體系包含2×SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司）、上下游引物、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒，最后進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。通過(guò)比較LRP6與內(nèi)參基因GAPDH的Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算LRP6mRNA的相對(duì)表達(dá)量。其次，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)心肌組織中LRP6蛋白的表達(dá)水平。將冷凍的心肌組織從-80℃冰箱取出，置于冰上解凍，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），用組織勻漿器充分勻漿，然后在4℃條件下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒（ThermoScientific公司）測(cè)定蛋白濃度。取等量的蛋白樣品（一般為30-50μg），加入上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳（根據(jù)LRP6蛋白的分子量選擇合適的凝膠濃度，如10%-12%的分離膠）。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司）上，在5%脫脂牛奶中室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。隨后，將PVDF膜與兔抗人LRP6多克隆抗體（Abcam公司，稀釋比例為1:1000）在4℃孵育過(guò)夜，次日用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，再與HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（JacksonImmunoResearch公司，稀釋比例為1:5000）室溫孵育1-2小時(shí)。最后，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL試劑盒，ThermoScientific公司）進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）下曝光成像，通過(guò)分析條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算LRP6蛋白的相對(duì)表達(dá)量。此外，對(duì)于部分心肌組織樣本，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)LRP6蛋白的表達(dá)和定位。將心肌組織用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋等處理，制成厚度為4μm的石蠟切片。切片脫蠟至水后，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。接著，用枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，采用微波修復(fù)法或高壓修復(fù)法，具體條件根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。修復(fù)后，切片自然冷卻至室溫，用正常山羊血清封閉30分鐘，以減少非特異性染色。隨后，將切片與兔抗人LRP6多克隆抗體（稀釋比例為1:200）在4℃孵育過(guò)夜，次日用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘，再與生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為1:200）室溫孵育30分鐘。再次用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘，然后與鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC）室溫孵育30分鐘。最后，用DAB顯色試劑盒（VectorLaboratories公司）進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后用中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察LRP6蛋白的表達(dá)情況，陽(yáng)性染色表現(xiàn)為棕黃色顆粒，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行半定量分析。2.1.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與結(jié)果分析運(yùn)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步采用LSD法或Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多組間分級(jí)資料比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)的分布類(lèi)型選擇合適的方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在LRP6mRNA表達(dá)水平方面，心力衰竭患者血漿中LRP6mRNA的相對(duì)表達(dá)量為[具體數(shù)值]，顯著高于健康對(duì)照組的[具體數(shù)值]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P<0.05）。在心肌組織中，心力衰竭患者LRP6mRNA的相對(duì)表達(dá)量同樣顯著高于健康對(duì)照組，分別為[具體數(shù)值]和[具體數(shù)值]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P<0.05）。這表明在心力衰竭患者中，LRP6在mRNA水平呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。對(duì)于LRP6蛋白表達(dá)水平，Westernblot結(jié)果顯示，心力衰竭患者心肌組織中LRP6蛋白的相對(duì)表達(dá)量為[具體數(shù)值]，明顯高于健康對(duì)照組的[具體數(shù)值]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P<0.05）。免疫組織化學(xué)結(jié)果也顯示，心力衰竭患者心肌組織中LRP6蛋白陽(yáng)性染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著增加。根據(jù)半定量分析結(jié)果，心力衰竭患者的免疫組織化學(xué)評(píng)分（IHC評(píng)分）為[具體評(píng)分范圍]，顯著高于健康對(duì)照組的[具體評(píng)分范圍]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=[Z值]，P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了在蛋白質(zhì)水平上，LRP6在心力衰竭患者心肌組織中表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步分析LRP6表達(dá)與心力衰竭嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián)。根據(jù)紐約心臟協(xié)會(huì)（NYHA）心功能分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將心力衰竭患者分為NYHAⅡ級(jí)、NYHAⅢ級(jí)和NYHAⅣ級(jí)三組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著NYHA心功能分級(jí)的升高，LRP6mRNA和蛋白的表達(dá)水平逐漸升高。NYHAⅡ級(jí)患者血漿LRP6mRNA相對(duì)表達(dá)量為[具體數(shù)值]，NYHAⅢ級(jí)患者為[具體數(shù)值]，NYHAⅣ級(jí)患者為[具體數(shù)值]，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=[F值]，P<0.05），進(jìn)一步兩兩比較顯示，NYHAⅢ級(jí)和Ⅳ級(jí)患者分別與NYHAⅡ級(jí)患者相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），NYHAⅣ級(jí)患者與NYHAⅢ級(jí)患者相比，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在心肌組織中，LRP6蛋白的表達(dá)也呈現(xiàn)類(lèi)似趨勢(shì)，NYHAⅡ級(jí)患者心肌組織LRP6蛋白相對(duì)表達(dá)量為[具體數(shù)值]，NYHAⅢ級(jí)患者為[具體數(shù)值]，NYHAⅣ級(jí)患者為[具體數(shù)值]，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=[F值]，P<0.05），兩兩比較結(jié)果與血漿LRP6mRNA表達(dá)一致。這表明LRP6的表達(dá)水平與心力衰竭的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，隨著心力衰竭病情的加重，LRP6的表達(dá)逐漸升高。此外，通過(guò)Pearson相關(guān)分析，研究LRP6表達(dá)與其他心力衰竭相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LRP6mRNA表達(dá)水平與左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）呈顯著負(fù)相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)]，P<0.05），即LRP6表達(dá)越高，LVEF越低；與N-端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）水平呈顯著正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)]，P<0.05），即LRP6表達(dá)越高，NT-proBNP水平越高。LRP6蛋白表達(dá)水平也與LVEF呈顯著負(fù)相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)]，P<0.05），與NT-proBNP水平呈顯著正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)]，P<0.05）。這進(jìn)一步表明LRP6的表達(dá)變化與心力衰竭患者的心功能狀態(tài)及病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可能在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。2.2LRP6基因多態(tài)性與心力衰竭易感性2.2.1基因多態(tài)性檢測(cè)為深入探究LRP6基因多態(tài)性與心力衰竭易感性的關(guān)聯(lián)，本研究選取了[具體時(shí)間段]在[具體醫(yī)院名稱(chēng)]心內(nèi)科住院且經(jīng)臨床確診為心力衰竭的患者[X]例作為病例組，同時(shí)選取同期在該醫(yī)院進(jìn)行健康體檢、年齡和性別相匹配的[X]名健康者作為對(duì)照組。心力衰竭的診斷依據(jù)嚴(yán)格遵循[具體的心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)，如《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南》的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)]，通過(guò)患者典型的心力衰竭癥狀（如呼吸困難、乏力、水腫等），結(jié)合心電圖、超聲心動(dòng)圖等檢查結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：近期（3個(gè)月內(nèi)）有急性心肌梗死、感染性心內(nèi)膜炎、惡性腫瘤等疾?。桓文I功能?chē)?yán)重障礙；自身免疫性疾病；近期使用過(guò)影響LRP6表達(dá)或Wnt信號(hào)通路的藥物等。在征得所有研究對(duì)象的知情同意后，于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集肘靜脈血5mL，置于含有抗凝劑（EDTA-K2）的采血管中，輕輕顛倒混勻，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，分離出血漿，將血漿分裝后保存于-80℃冰箱待測(cè)。同時(shí)，采集部分患者的心肌組織樣本，這些樣本來(lái)源于因心臟疾病接受心臟手術(shù)（如冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、心臟瓣膜置換術(shù)等）的患者，在手術(shù)過(guò)程中，于心臟病變部位（對(duì)于心力衰竭患者，主要采集左心室心肌組織）切取約0.5g的心肌組織，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。對(duì)于健康對(duì)照組，由于無(wú)法獲取心肌組織，我們參考以往相關(guān)研究中正常心肌組織的LRP6基因多態(tài)性數(shù)據(jù)作為對(duì)照。為檢測(cè)LRP6基因多態(tài)性，我們采用了聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)。首先，使用基因組DNA提取試劑盒（Qiagen公司）提取血漿和心肌組織中的基因組DNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行，確保提取的DNA純度和完整性良好。通過(guò)測(cè)定260nm和280nm處的吸光度值（A260/A280）來(lái)評(píng)估DNA的純度，理想的A260/A280比值應(yīng)在1.7-2.0之間。然后，根據(jù)LRP6基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)借助專(zhuān)業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件（如PrimerPremier5.0）完成，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。LRP6基因引物序列為：上游引物5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物5'-[具體堿基序列]-3'。以提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包含2×TaqPCRMasterMix（TaKaRa公司）、上下游引物、DNA模板和ddH?O，總體積為25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的95℃變性30秒、[退火溫度]℃退火30秒、72℃延伸30秒，最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）下觀察擴(kuò)增條帶，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和條帶清晰。將擴(kuò)增成功的產(chǎn)物用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶（根據(jù)LRP6基因多態(tài)性位點(diǎn)選擇合適的限制性?xún)?nèi)切酶，如BsmBI、HindⅢ等）進(jìn)行酶切反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系包含PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、限制性?xún)?nèi)切酶、10×Buffer和ddH?O，總體積為20μL，按照限制性?xún)?nèi)切酶說(shuō)明書(shū)的條件進(jìn)行酶切，一般在37℃水浴鍋中孵育3-4小時(shí)。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%-3%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察酶切條帶的大小和數(shù)量。根據(jù)酶切條帶的不同，判斷LRP6基因的多態(tài)性類(lèi)型。例如，若出現(xiàn)兩條不同大小的條帶，則表示該樣本存在LRP6基因的多態(tài)性位點(diǎn)；若只有一條條帶，則表示該樣本在該位點(diǎn)為純合子。除了PCR-RFLP技術(shù)，我們還采用了直接測(cè)序法對(duì)部分樣本進(jìn)行驗(yàn)證。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，送專(zhuān)業(yè)的測(cè)序公司（如華大基因）進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)序列分析軟件（如Chromas、DNAMAN等）與LRP6基因的參考序列進(jìn)行比對(duì)，準(zhǔn)確確定基因多態(tài)性位點(diǎn)的堿基變化情況，進(jìn)一步提高基因多態(tài)性檢測(cè)的準(zhǔn)確性。2.2.2關(guān)聯(lián)分析與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估運(yùn)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。首先，對(duì)病例組和對(duì)照組的一般臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，分析兩組在年齡、性別、血壓、血糖、血脂等因素上是否具有可比性。對(duì)于LRP6基因多態(tài)性與心力衰竭易感性的關(guān)聯(lián)分析，采用χ2檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組中不同LRP6基因型和等位基因的分布頻率差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，若某基因型或等位基因在病例組中的分布頻率顯著高于對(duì)照組，則提示該基因型或等位基因可能與心力衰竭的易感性增加相關(guān)；反之，若在病例組中的分布頻率顯著低于對(duì)照組，則可能與心力衰竭的易感性降低相關(guān)。進(jìn)一步進(jìn)行Logistic回歸分析，納入年齡、性別、血壓、血糖、血脂等可能的混雜因素，以校正其他因素對(duì)結(jié)果的影響，評(píng)估LRP6基因多態(tài)性與心力衰竭易感性之間的獨(dú)立關(guān)聯(lián)。計(jì)算優(yōu)勢(shì)比（OR）及其95%置信區(qū)間（CI），OR值大于1表示該基因型或等位基因是心力衰竭的危險(xiǎn)因素，OR值越大，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)越高；OR值小于1表示該基因型或等位基因是心力衰竭的保護(hù)因素。例如，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，LRP6基因的rs[具體位點(diǎn)編號(hào)]位點(diǎn)存在C/T多態(tài)性，在病例組中CC基因型的頻率為[具體數(shù)值]，CT基因型的頻率為[具體數(shù)值]，TT基因型的頻率為[具體數(shù)值]；在對(duì)照組中CC基因型的頻率為[具體數(shù)值]，CT基因型的頻率為[具體數(shù)值]，TT基因型的頻率為[具體數(shù)值]。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，病例組和對(duì)照組中該位點(diǎn)不同基因型的分布頻率存在顯著差異（χ2=[具體χ2值]，P<0.05）。進(jìn)一步的Logistic回歸分析表明，在校正年齡、性別、血壓、血糖、血脂等因素后，與CC基因型相比，TT基因型的OR值為[具體OR值]（95%CI：[下限值]-[上限值]，P<0.05），提示TT基因型可能是心力衰竭的危險(xiǎn)因素，攜帶TT基因型的個(gè)體發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶CC基因型個(gè)體的[具體倍數(shù)]倍。此外，為了評(píng)估不同基因型個(gè)體的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，我們還可以進(jìn)行分層分析。根據(jù)NYHA心功能分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將心力衰竭患者分為不同亞組，分析不同基因型在各亞組中的分布情況，以及與心功能分級(jí)的相關(guān)性。例如，在NYHAⅡ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)心力衰竭患者中，分別統(tǒng)計(jì)LRP6基因不同基因型的頻率，采用趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)分析基因型頻率是否隨NYHA心功能分級(jí)的升高而呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)。若存在顯著的趨勢(shì)變化，則表明不同基因型與心力衰竭的嚴(yán)重程度相關(guān)，進(jìn)一步提示不同基因型個(gè)體的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在差異。同時(shí)，還可以結(jié)合其他臨床指標(biāo)，如左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、N-端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）水平等，分析LRP6基因多態(tài)性與這些指標(biāo)的關(guān)聯(lián)，全面評(píng)估不同基因型個(gè)體的心力衰竭發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和病情嚴(yán)重程度。三、LRP6在心力衰竭發(fā)生發(fā)展中的作用3.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建與驗(yàn)證3.1.1壓力超負(fù)荷心力衰竭動(dòng)物模型本研究選用雄性C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，小鼠周齡為8-10周，體重在20-25g之間。選擇該品系小鼠的原因在于其遺傳背景清晰，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的反應(yīng)較為穩(wěn)定，且在心血管疾病研究中應(yīng)用廣泛，相關(guān)的研究資料和數(shù)據(jù)較為豐富，有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和對(duì)比。此外，雄性小鼠在心血管生理和病理反應(yīng)上相對(duì)雌性小鼠更為一致，能減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果的個(gè)體差異。采用主動(dòng)脈弓縮窄（TAC）手術(shù)構(gòu)建壓力超負(fù)荷心力衰竭動(dòng)物模型。具體手術(shù)步驟如下：首先，將小鼠置于氣體麻醉機(jī)中，以2%-3%的異氟醚與氧氣混合氣體進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，待小鼠麻醉后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，用碘伏對(duì)頸部和胸部手術(shù)區(qū)域進(jìn)行消毒，消毒范圍包括頸部正中、胸部正中及兩側(cè)胸部。沿頸部正中切開(kāi)皮膚，長(zhǎng)度約為1-1.5cm，鈍性分離頸部肌肉，暴露氣管和血管。在左側(cè)鎖骨下動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈之間找到主動(dòng)脈弓，用6-0絲線(xiàn)在主動(dòng)脈弓下方穿過(guò)，將一根26G注射針頭平行放置于主動(dòng)脈弓旁，然后將絲線(xiàn)結(jié)扎在主動(dòng)脈弓和注射針頭上，注意結(jié)扎力度適中，以能順利抽出注射針頭且主動(dòng)脈弓有一定程度縮窄為宜，隨后小心抽出注射針頭，使主動(dòng)脈弓形成約70%-80%的縮窄，最后逐層縫合肌肉和皮膚，完成手術(shù)。術(shù)后對(duì)小鼠進(jìn)行精心護(hù)理，將小鼠放置在37℃的加熱墊上，直至其蘇醒，以維持小鼠的體溫，防止低體溫對(duì)小鼠身體機(jī)能產(chǎn)生不良影響。給予小鼠充足的食物和水，密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力等一般情況。若發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)異常癥狀，如精神萎靡、呼吸困難、傷口感染等，及時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的處理。為防止感染，術(shù)后連續(xù)3天給予小鼠腹腔注射青霉素，劑量為10萬(wàn)U/kg。在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)（如1周、2周、4周、8周）對(duì)小鼠進(jìn)行心功能檢測(cè)，以驗(yàn)證模型是否成功。采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠的心功能指標(biāo)，使用配備高頻探頭（10-15MHz）的超聲診斷儀，將小鼠麻醉后，仰臥位固定于超聲檢查臺(tái)上，在胸部涂抹適量的超聲耦合劑，進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。主要檢測(cè)指標(biāo)包括左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（FS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）。正常小鼠的LVEF通常在60%-70%之間，F(xiàn)S在30%-40%之間，LVEDd在3.5-4.5mm之間，LVESd在2.0-3.0mm之間。在TAC手術(shù)后，隨著時(shí)間的推移，小鼠的LVEF和FS逐漸降低，LVEDd和LVESd逐漸增大。例如，術(shù)后4周時(shí)，TAC組小鼠的LVEF可降至40%-50%，F(xiàn)S降至20%-30%，LVEDd增大至5.0-6.0mm，LVESd增大至3.5-4.5mm，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明壓力超負(fù)荷心力衰竭動(dòng)物模型構(gòu)建成功。此外，還可以通過(guò)檢測(cè)小鼠的心肌肥厚指標(biāo)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證模型。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死小鼠，迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗干凈，去除心房和大血管，分離左心室，用濾紙吸干水分，稱(chēng)取左心室重量（LVW），同時(shí)測(cè)量小鼠的體重（BW）和脛骨長(zhǎng)度（TL），計(jì)算左心室重量與體重的比值（LVW/BW）和左心室重量與脛骨長(zhǎng)度的比值（LVW/TL）。正常小鼠的LVW/BW一般在2.5-3.5mg/g之間，LVW/TL在10.0-15.0mg/mm之間。TAC手術(shù)后，小鼠的LVW/BW和LVW/TL顯著增加，術(shù)后4周時(shí)，TAC組小鼠的LVW/BW可升高至4.0-5.0mg/g，LVW/TL升高至15.0-20.0mg/mm，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示心肌肥厚明顯，進(jìn)一步證實(shí)壓力超負(fù)荷心力衰竭動(dòng)物模型構(gòu)建成功。3.1.2心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠模型構(gòu)建心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠模型采用Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理是基于Cre重組酶能夠識(shí)別并結(jié)合LoxP位點(diǎn)，介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的DNA片段發(fā)生重組。在構(gòu)建心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠模型時(shí)，首先需要構(gòu)建帶有LoxP位點(diǎn)的LRP6基因打靶載體。通過(guò)基因克隆技術(shù)，將LoxP位點(diǎn)插入到LRP6基因的關(guān)鍵外顯子兩側(cè)，使得在Cre重組酶存在的情況下，這兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的外顯子能夠被切除，從而實(shí)現(xiàn)LRP6基因的敲除。然后，將構(gòu)建好的打靶載體通過(guò)電穿孔等方法導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）中，利用同源重組的原理，使打靶載體與ES細(xì)胞基因組中的LRP6基因發(fā)生同源重組，將LoxP位點(diǎn)整合到ES細(xì)胞基因組中。通過(guò)藥物篩選和PCR鑒定等方法，篩選出發(fā)生正確同源重組的ES細(xì)胞克隆。將篩選得到的陽(yáng)性ES細(xì)胞克隆注射到小鼠囊胚中，然后將注射后的囊胚移植到假孕母鼠的子宮內(nèi)，使其發(fā)育成嵌合體小鼠。嵌合體小鼠中部分細(xì)胞來(lái)源于注射的ES細(xì)胞，部分細(xì)胞來(lái)源于受體囊胚細(xì)胞。通過(guò)與野生型小鼠交配，將攜帶LoxP位點(diǎn)的LRP6基因傳遞給后代，經(jīng)過(guò)多代繁殖和篩選，獲得純合的LRP6flox/flox小鼠。為了實(shí)現(xiàn)心肌特異性敲除LRP6基因，將LRP6flox/flox小鼠與心肌特異性表達(dá)Cre重組酶的小鼠（如α-MHC-Cre小鼠）進(jìn)行雜交。α-MHC-Cre小鼠在心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)Cre重組酶，當(dāng)LRP6flox/flox小鼠與α-MHC-Cre小鼠雜交后，在子代小鼠的心肌細(xì)胞中，Cre重組酶會(huì)識(shí)別并結(jié)合LRP6基因兩側(cè)的LoxP位點(diǎn)，介導(dǎo)LoxP位點(diǎn)之間的外顯子切除，從而實(shí)現(xiàn)心肌特異性L(fǎng)RP6基因敲除，獲得心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠（LRP6flox/flox;α-MHC-Cre）。對(duì)于構(gòu)建好的心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠，需要進(jìn)行鑒定以確保基因敲除的準(zhǔn)確性和特異性。首先，采用PCR技術(shù)鑒定小鼠的基因型。提取小鼠尾巴組織的基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物，引物分別針對(duì)LRP6基因的野生型序列、帶有LoxP位點(diǎn)的序列以及Cre重組酶基因序列。通過(guò)PCR擴(kuò)增，若擴(kuò)增出野生型LRP6基因條帶，則表明該小鼠為野生型；若擴(kuò)增出帶有LoxP位點(diǎn)的LRP6基因條帶，則表明該小鼠為L(zhǎng)RP6flox/flox小鼠；若同時(shí)擴(kuò)增出帶有LoxP位點(diǎn)的LRP6基因條帶和Cre重組酶基因條帶，則表明該小鼠為心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠（LRP6flox/flox;α-MHC-Cre）。其次，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)心肌組織中LRP6蛋白的表達(dá)水平。取小鼠的心肌組織，提取總蛋白，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性的抗LRP6抗體進(jìn)行雜交，檢測(cè)LRP6蛋白的表達(dá)情況。在野生型小鼠心肌組織中，可檢測(cè)到明顯的LRP6蛋白條帶；而在心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠心肌組織中，LRP6蛋白條帶應(yīng)明顯減弱或消失，表明LRP6基因在心肌組織中成功敲除。此外，還可以采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)LRP6蛋白在心肌組織中的表達(dá)和定位，進(jìn)一步驗(yàn)證基因敲除的效果和特異性。將小鼠心肌組織制成石蠟切片，用特異性的抗LRP6抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，在顯微鏡下觀察LRP6蛋白的表達(dá)和定位情況。在野生型小鼠心肌組織中，LRP6蛋白主要表達(dá)于心肌細(xì)胞膜上；而在心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠心肌組織中，心肌細(xì)胞膜上的LRP6蛋白表達(dá)明顯減少或消失，且其他組織（如肝臟、腎臟等）中LRP6蛋白表達(dá)不受影響，表明LRP6基因在心肌組織中實(shí)現(xiàn)了特異性敲除。3.2LRP6對(duì)心肌肥厚的影響3.2.1心肌肥厚指標(biāo)檢測(cè)在壓力超負(fù)荷心力衰竭動(dòng)物模型（主動(dòng)脈弓縮窄TAC手術(shù)構(gòu)建）和心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠模型的基礎(chǔ)上，對(duì)心肌肥厚相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于心肌細(xì)胞形態(tài)觀察，取部分左心室心肌組織，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋等常規(guī)處理，制成厚度為4μm的石蠟切片。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法，將石蠟切片脫蠟至水后，依次用蘇木精染液染色細(xì)胞核，水洗后用伊紅染液染色細(xì)胞質(zhì)，再經(jīng)過(guò)脫水、透明處理后，用中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)，正常心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊，而心肌肥厚時(shí)心肌細(xì)胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核增大、深染。通過(guò)測(cè)量心肌細(xì)胞的橫截面積來(lái)定量分析心肌細(xì)胞的大小變化，在顯微鏡下隨機(jī)選取多個(gè)視野（一般每個(gè)樣本選取5-10個(gè)視野），使用圖像分析軟件（如Image-ProPlus）測(cè)量每個(gè)視野中至少50個(gè)心肌細(xì)胞的橫截面積，計(jì)算平均值作為該樣本心肌細(xì)胞的平均橫截面積。在檢測(cè)心肌肥厚標(biāo)志物表達(dá)水平時(shí)，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)心房利鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）和β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）等mRNA的表達(dá)水平。提取心肌組織總RNA的方法與前文臨床樣本檢測(cè)一致，使用TRIzol試劑提取總RNA，確保RNA的純度和完整性，通過(guò)測(cè)定A260/A280比值評(píng)估RNA質(zhì)量。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。ANP引物序列為：上游引物5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物5'-[具體堿基序列]-3'；BNP引物序列為：上游引物5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物5'-[具體堿基序列]-3'；β-MHC引物序列為：上游引物5'-[具體堿基序列]-3'，下游引物5'-[具體堿基序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列前文已提及。反應(yīng)體系和條件與臨床樣本檢測(cè)類(lèi)似，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算各肥厚標(biāo)志物mRNA的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)ANP、BNP和β-MHC等蛋白的表達(dá)水平。取心肌組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)各蛋白的分子量選擇合適的凝膠濃度，如10%-12%的分離膠。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1-2小時(shí)，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后與相應(yīng)的一抗（兔抗ANP多克隆抗體、兔抗BNP多克隆抗體、兔抗β-MHC多克隆抗體，稀釋比例一般為1:1000-1:2000，均購(gòu)自Abcam公司等知名抗體供應(yīng)商）在4℃孵育過(guò)夜，次日用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，再與HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為1:5000-1:10000）室溫孵育1-2小時(shí)。最后用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL試劑盒）進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光成像，以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)分析條帶的灰度值計(jì)算各肥厚標(biāo)志物蛋白的相對(duì)表達(dá)量。為了評(píng)估心肌纖維化程度，采用Masson染色法對(duì)心肌組織石蠟切片進(jìn)行染色。將石蠟切片脫蠟至水后，用Weigert鐵蘇木精染液染色細(xì)胞核，水洗后用Masson藍(lán)化液處理，再用麗春紅酸性品紅染液染色細(xì)胞質(zhì)和膠原纖維，然后用磷鉬酸溶液分化，最后用苯胺藍(lán)染液復(fù)染膠原纖維，脫水、透明后用中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，正常心肌組織中膠原纖維呈藍(lán)色，分布較少，而心肌纖維化時(shí)膠原纖維增多，呈藍(lán)色條索狀或片狀分布。通過(guò)圖像分析軟件計(jì)算心肌組織中膠原纖維的面積百分比，以此來(lái)定量評(píng)估心肌纖維化程度，在顯微鏡下隨機(jī)選取多個(gè)視野（一般每個(gè)樣本選取5-10個(gè)視野），測(cè)量每個(gè)視野中膠原纖維的面積和心肌組織總面積，計(jì)算膠原纖維面積占心肌組織總面積的百分比。3.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與作用分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在壓力超負(fù)荷心力衰竭動(dòng)物模型中，與假手術(shù)組相比，TAC組小鼠的心肌細(xì)胞橫截面積顯著增大。假手術(shù)組小鼠心肌細(xì)胞平均橫截面積為[X]μm2，TAC組小鼠心肌細(xì)胞平均橫截面積增大至[X+ΔX]μm2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，TAC組小鼠心肌組織中ANP、BNP和β-MHC等心肌肥厚標(biāo)志物的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高。qRT-PCR結(jié)果顯示，TAC組小鼠ANPmRNA相對(duì)表達(dá)量為假手術(shù)組的[倍數(shù)1]倍，BNPmRNA相對(duì)表達(dá)量為假手術(shù)組的[倍數(shù)2]倍，β-MHCmRNA相對(duì)表達(dá)量為假手術(shù)組的[倍數(shù)3]倍；Westernblot結(jié)果顯示，TAC組小鼠ANP蛋白相對(duì)表達(dá)量為假手術(shù)組的[倍數(shù)4]倍，BNP蛋白相對(duì)表達(dá)量為假手術(shù)組的[倍數(shù)5]倍，β-MHC蛋白相對(duì)表達(dá)量為假手術(shù)組的[倍數(shù)6]倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明壓力超負(fù)荷可成功誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚，心肌細(xì)胞體積增大，肥厚標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)。在心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠模型中，與對(duì)照組（LRP6flox/flox小鼠）相比，心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠（LRP6flox/flox;α-MHC-Cre）的心肌細(xì)胞橫截面積進(jìn)一步增大。對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞平均橫截面積為[X]μm2，心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠心肌細(xì)胞平均橫截面積增大至[X+ΔX']μm2，且ΔX'>ΔX，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠心肌組織中ANP、BNP和β-MHC等心肌肥厚標(biāo)志物的mRNA和蛋白表達(dá)水平也顯著高于對(duì)照組。qRT-PCR結(jié)果顯示，心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠ANPmRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的[倍數(shù)7]倍，BNPmRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的[倍數(shù)8]倍，β-MHCmRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的[倍數(shù)9]倍；Westernblot結(jié)果顯示，心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠ANP蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的[倍數(shù)10]倍，BNP蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的[倍數(shù)11]倍，β-MHC蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的[倍數(shù)12]倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明LRP6基因敲除會(huì)加重壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚，使心肌細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，肥厚標(biāo)志物表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)。相反，在過(guò)表達(dá)LRP6的細(xì)胞模型或動(dòng)物模型中，結(jié)果呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，在心肌細(xì)胞或小鼠心肌組織中過(guò)表達(dá)LRP6。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)LRP6組的心肌細(xì)胞橫截面積明顯減小。對(duì)照組心肌細(xì)胞平均橫截面積為[X]μm2，過(guò)表達(dá)LRP6組心肌細(xì)胞平均橫截面積減小至[X-ΔX'']μm2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，過(guò)表達(dá)LRP6組心肌組織中ANP、BNP和β-MHC等心肌肥厚標(biāo)志物的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低。qRT-PCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)LRP6組ANPmRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的[倍數(shù)13]倍，BNPmRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的[倍數(shù)14]倍，β-MHCmRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的[倍數(shù)15]倍，且各倍數(shù)均小于1；Westernblot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)LRP6組ANP蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的[倍數(shù)16]倍，BNP蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的[倍數(shù)17]倍，β-MHC蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的[倍數(shù)18]倍，各倍數(shù)也均小于1，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明過(guò)表達(dá)LRP6能夠抑制心肌肥厚，使心肌細(xì)胞體積減小，肥厚標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出LRP6在心肌肥厚進(jìn)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。LRP6缺失會(huì)加劇壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚，而LRP6過(guò)表達(dá)則可抑制心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。其作用機(jī)制可能與LRP6參與的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路以及其他相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。LRP6作為Wnt信號(hào)通路的共受體，在Wnt配體存在時(shí)，與Frizzled受體結(jié)合形成復(fù)合物，激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，從而影響心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化。當(dāng)LRP6缺失時(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能受到抑制，導(dǎo)致心肌細(xì)胞對(duì)壓力超負(fù)荷的代償反應(yīng)異常，進(jìn)而加重心肌肥厚；而過(guò)表達(dá)LRP6則可能增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性，促進(jìn)心肌細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝，抑制心肌肥厚的發(fā)生。此外，LRP6還可能通過(guò)與其他信號(hào)通路（如MAPK信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路等）的相互作用，共同調(diào)節(jié)心肌肥厚的進(jìn)程。3.3LRP6對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控3.3.1細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)在研究LRP6對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控時(shí)，運(yùn)用了多種細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)，這些技術(shù)從不同角度和層面揭示心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。TUNEL（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling）法是一種常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法，其原理基于細(xì)胞凋亡時(shí)染色體DNA的斷裂。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，內(nèi)源性核酸水解酶首先將染色體DNA降解為50-300kb的大片段，隨后約30%的染色體DNA在Ca2?和Mg2?依賴(lài)的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180-200bp核小體DNA多聚體。這些DNA雙鏈斷裂或單鏈缺口產(chǎn)生的3’-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。具體操作步驟如下：首先，取心肌組織，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋等常規(guī)處理，制成厚度為4μm的石蠟切片。將石蠟切片脫蠟至水，用蛋白酶K溶液（20μg/ml）在37℃孵育15-20分鐘，進(jìn)行抗原修復(fù)，以暴露DNA斷裂位點(diǎn)。用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，然后加入TdT酶和生物素-16-dUTP標(biāo)記液，在37℃濕盒中孵育60分鐘，使TdT酶將生物素-16-dUTP連接到DNA的3’-OH末端。用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫孵育30分鐘，使HRP與生物素結(jié)合。再次用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，加入DAB顯色液，室溫孵育5-10分鐘，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性染色時(shí)，終止顯色反應(yīng)。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后用中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色，而正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色。AnnexinV-FITC/PI雙染法也是一種廣泛應(yīng)用的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法，其原理基于細(xì)胞凋亡早期細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面。AnnexinV是一種分子量為35-36KD的Ca2?依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，與PS具有高親和力。將AnnexinV進(jìn)行異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的AnnexinV作為探針，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時(shí)，碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染，因此通過(guò)AnnexinV-FITC和PI雙染，可以區(qū)分正常細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。操作步驟如下：取培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/ml。取100μl細(xì)胞懸液，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。加入400μl的BindingBuffer，再次輕輕混勻，在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，設(shè)置FITC為綠色熒光通道，PI為紅色熒光通道，通過(guò)分析散點(diǎn)圖上不同象限內(nèi)細(xì)胞的分布情況，計(jì)算出正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞的比例。此外，還可以通過(guò)檢測(cè)Caspase酶活性來(lái)評(píng)估心肌細(xì)胞凋亡。Caspase家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它們是一組半胱氨酸蛋白酶，正常情況下以無(wú)活性的酶原形式存在于細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Caspase酶原被激活，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)切割一系列底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。檢測(cè)Caspase-3活性時(shí)，采用比色法檢測(cè)試劑盒。取心肌組織或培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃條件下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，收集上清液。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，將上清液與反應(yīng)緩沖液、底物（Ac-DEVD-pNA）混合，37℃孵育1-2小時(shí)，Caspase-3會(huì)切割底物，釋放出對(duì)硝基苯胺（pNA），pNA在405nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出Caspase-3的活性。吸光度值越高，表明Caspase-3活性越高，細(xì)胞凋亡程度越嚴(yán)重。3.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與機(jī)制探討實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在壓力超負(fù)荷心力衰竭動(dòng)物模型中，與假手術(shù)組相比，TAC組小鼠心肌組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。TUNEL染色結(jié)果表明，假手術(shù)組小鼠心肌組織中凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性率僅為[X]%，而TAC組小鼠心肌組織中凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性率升高至[X+ΔX]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞凋亡情況也得到了類(lèi)似結(jié)果，TAC組心肌細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率之和明顯高于假手術(shù)組，分別為[具體早期凋亡率+晚期凋亡率]和[具體早期凋亡率+晚期凋亡率]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，TAC組小鼠心肌組織中Caspase-3的活性顯著升高，是假手術(shù)組的[倍數(shù)]倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明壓力超負(fù)荷可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量減少，心功能受損。在心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠模型中，與對(duì)照組（LRP6flox/flox小鼠）相比，心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠（LRP6flox/flox;α-MHC-Cre）心肌組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)一步增加。TUNEL染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠心肌組織中凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性率為[X]%，而心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠心肌組織中凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性率升高至[X+ΔX']%，且ΔX'>ΔX，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果表明，心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠心肌細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率之和顯著高于對(duì)照組，分別為[具體早期凋亡率+晚期凋亡率]和[具體早期凋亡率+晚期凋亡率]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠心肌組織中Caspase-3的活性也顯著高于對(duì)照組，是對(duì)照組的[倍數(shù)]倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明LRP6基因敲除會(huì)加重壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步損傷心肌功能。相反，在過(guò)表達(dá)LRP6的細(xì)胞模型或動(dòng)物模型中，心肌細(xì)胞凋亡受到抑制。通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，在心肌細(xì)胞或小鼠心肌組織中過(guò)表達(dá)LRP6。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)LRP6組心肌組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。TUNEL染色結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)LRP6組小鼠心肌組織中凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性率降低至[X-ΔX'']%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)LRP6組心肌細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率之和顯著低于對(duì)照組，分別為[具體早期凋亡率+晚期凋亡率]和[具體早期凋亡率+晚期凋亡率]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，過(guò)表達(dá)LRP6組心肌組織中Caspase-3的活性顯著降低，是對(duì)照組的[倍數(shù)]倍，且倍數(shù)小于1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明過(guò)表達(dá)LRP6能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌起到保護(hù)作用。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，LRP6在心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。LRP6缺失會(huì)加劇壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，而過(guò)表達(dá)LRP6則可抑制心肌細(xì)胞凋亡。其調(diào)控機(jī)制可能與LRP6參與的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路以及其他相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)。在經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，LRP6作為共受體，與Frizzled受體結(jié)合形成復(fù)合物，激活下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制GSK-3β的活性，從而阻止β-catenin的磷酸化和降解，使β-catenin得以穩(wěn)定積累并進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控一系列抗凋亡基因的表達(dá)，如Bcl-2等，抑制心肌細(xì)胞凋亡。當(dāng)LRP6缺失時(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路受到抑制，β-catenin的穩(wěn)定性降低，進(jìn)入細(xì)胞核的β-catenin減少，抗凋亡基因的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增加。此外，LRP6還可能通過(guò)與其他信號(hào)通路（如PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等）的相互作用，共同調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活和凋亡調(diào)控中起著重要作用，LRP6可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)Akt的磷酸化，進(jìn)而激活下游的抗凋亡蛋白，抑制心肌細(xì)胞凋亡；而在MAPK信號(hào)通路中，LRP6可能通過(guò)調(diào)節(jié)ERK、JNK和p38等激酶的活性，影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，從而調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡。3.4LRP6對(duì)心臟功能的影響3.4.1心臟功能評(píng)估指標(biāo)與方法在研究LRP6對(duì)心臟功能的影響時(shí)，運(yùn)用了多種先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)和指標(biāo)來(lái)全面、準(zhǔn)確地評(píng)估心臟功能。超聲心動(dòng)圖是一種常用且重要的檢測(cè)方法，它具有無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崟r(shí)觀察心臟的結(jié)構(gòu)和功能變化。在本研究中，采用配備高頻探頭（10-15MHz）的超聲診斷儀對(duì)小鼠進(jìn)行檢測(cè)。將小鼠麻醉后，仰臥位固定于超聲檢查臺(tái)上，在胸部涂抹適量的超聲耦合劑，以確保超聲信號(hào)的良好傳導(dǎo)。主要檢測(cè)指標(biāo)包括左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（FS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）。LVEF是指左心室每次收縮時(shí)射出的血量占左心室舒張末期容積的百分比，它反映了心臟的收縮功能，正常小鼠的LVEF通常在60%-70%之間。FS是指左心室短軸縮短的程度，也是評(píng)估心臟收縮功能的重要指標(biāo)，正常小鼠的FS在30%-40%之間。LVEDd和LVESd分別反映了左心室在舒張末期和收縮末期的內(nèi)徑大小，正常小鼠的LVEDd在3.5-4.5mm之間，LVESd在2.0-3.0mm之間。通過(guò)測(cè)量這些指標(biāo)，可以準(zhǔn)確評(píng)估心臟的收縮和舒張功能狀態(tài)。除了超聲心動(dòng)圖，還采用了血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)技術(shù)來(lái)深入了解心臟的功能。血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)可以直接測(cè)量心臟內(nèi)的壓力和血流變化，為評(píng)估心臟功能提供更精確的數(shù)據(jù)。在本研究中，采用壓力-容積（P-V）導(dǎo)管技術(shù)進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。具體操作時(shí)，將P-V導(dǎo)管經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入左心室，通過(guò)連接壓力傳感器和容積傳感器，實(shí)時(shí)記錄左心室壓力（LVP）、左心室舒張末期壓力（LVEDP）、左心室壓力最大上升速率（dp/dtmax）和左心室壓力最大下降速率（dp/dtmin）等指標(biāo)。LVP反映了左心室在收縮和舒張過(guò)程中的壓力變化，正常情況下，左心室在收縮期壓力迅速升高，在舒張期壓力逐漸降低。LVEDP是指左心室在舒張末期的壓力，它反映了心臟的舒張功能和心室充盈情況，正常小鼠的LVEDP一般在5-10mmHg之間。dp/dtmax代表左心室壓力上升的最大速率，它反映了心肌的收縮性能，正常小鼠的dp/dtmax通常在8000-12000mmHg/s之間。dp/dtmin代表左心室壓力下降的最大速率，它反映了心肌的舒張性能，正常小鼠的dp/dtmin在-6000--8000mmHg/s之間。通過(guò)這些血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的測(cè)量，可以更全面、準(zhǔn)確地評(píng)估心臟的收縮和舒張功能，以及心肌的力學(xué)特性。此外，還可以通過(guò)檢測(cè)一些與心臟功能相關(guān)的生物標(biāo)志物來(lái)輔助評(píng)估心臟功能。例如，N-端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）是一種由心室肌細(xì)胞分泌的肽類(lèi)激素，當(dāng)心臟功能受損時(shí)，心室壁張力增加，會(huì)刺激NT-proBNP的分泌和釋放。在本研究中，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)小鼠血漿中NT-proBNP的水平。具體操作步驟如下：將小鼠麻醉后，采集心臟血液，離心分離血漿，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。首先，將血漿樣本加入到包被有抗NT-proBNP抗體的微孔板中，孵育一段時(shí)間，使NT-proBNP與抗體結(jié)合。然后，洗滌微孔板，去除未結(jié)合的物質(zhì)，加入酶標(biāo)記的抗NT-proBNP抗體，孵育后再次洗滌。最后，加入底物溶液，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出血漿中NT-proBNP的濃度。NT-proBNP水平的升高通常提示心臟功能受損，其濃度與心力衰竭的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，因此可以作為評(píng)估心臟功能的重要生物標(biāo)志物之一。3.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與功能分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在壓力超負(fù)荷心力衰竭動(dòng)物模型中，與假手術(shù)組相比，TAC組小鼠的心臟功能明顯受損。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果表明，TAC組小鼠的LVEF顯著降低，從假手術(shù)組的[X]%降至[X-ΔX]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；FS也顯著下降，從假手術(shù)組的[X]%降至[X-ΔX]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，LVEDd和LVESd顯著增大，LVEDd從假手術(shù)組的[X]mm增大至[X+ΔX]mm，LVESd從假手術(shù)組的[X]mm增大至[X+ΔX]mm，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心臟收縮功能下降，左心室擴(kuò)張，心功能受損。在心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠模型中，與對(duì)照組（LRP6flox/flox小鼠）相比，心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠（LRP6flox/flox;α-MHC-Cre）的心臟功能進(jìn)一步惡化。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果顯示，心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠的LVEF進(jìn)一步降低，降至[X-ΔX']%，且ΔX'>ΔX，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；FS也進(jìn)一步下降，降至[X-ΔX']%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。LVEDd和LVESd進(jìn)一步增大，LVEDd增大至[X+ΔX']mm，LVESd增大至[X+ΔX']mm，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明LRP6基因敲除會(huì)加重壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟功能損傷，使心臟收縮功能進(jìn)一步下降，左心室擴(kuò)張更為明顯。血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了上述結(jié)論。在壓力超負(fù)荷心力衰竭動(dòng)物模型中，TAC組小鼠的LVP、LVEDP顯著升高，dp/dtmax顯著降低，dp/dtmin顯著升高。與假手術(shù)組相比，TAC組小鼠的LVP從[X]mmHg升高至[X+ΔX]mmHg，LVEDP從[X]mmHg升高至[X+ΔX]mmHg，dp/dtmax從[X]mmHg/s降低至[X-ΔX]mmHg/s，dp/dtmin從[X]mmHg/s升高至[X+ΔX]mmHg/s，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠模型中，與對(duì)照組相比，心肌特異性L(fǎng)RP6敲除小鼠的LVP、LVEDP進(jìn)一步升高，dp/dtmax進(jìn)一步降低，dp/dtmin進(jìn)一步升高。LVP升高至[X+ΔX']mmHg，LVEDP升高至[X+ΔX']mmHg，dp/dtmax降低至[X-ΔX']mmHg