ICS11.220CCSB41DB36江西省地方標(biāo)準(zhǔn)DB36/T1846—2023家畜化膿隱秘桿菌病診斷技術(shù)規(guī)范DiagnosticspecificationsforTrueperellapyogenesdiseaseinlivestock江西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布DB36/T1846—2023前??言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口；本文件起草單位：江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、贛州市畜牧業(yè)發(fā)展和動(dòng)物疫病防控中心。本文件主要起草人：譚美芳、楊群、曾艷兵、李海琴、季華員、譚佳、張帆帆、方紹培、黃美峰、吳誠(chéng)誠(chéng)、饒煜玲。IDB36/T1846—2023家畜化膿隱秘桿菌病診斷技術(shù)規(guī)范1范圍本文件規(guī)定了家畜化膿隱秘桿菌病診斷的術(shù)語(yǔ)和定義、試劑與器材、臨床診斷、病原菌的分離培養(yǎng)、病原菌的鑒定、結(jié)果判定和生物安全。本文件適用于牛、羊、豬等家畜化膿隱秘桿菌病的診斷、檢疫及流行病學(xué)調(diào)查。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4789.6-2003食品微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)GB/T4789.28食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB19489NY/T541實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3化膿隱秘桿菌，原稱化膿棒狀桿菌、化膿放線菌，屬于放線菌科隱秘桿菌屬，是一種無莢膜、無芽孢、無鞭毛、不運(yùn)動(dòng)的短棒狀桿菌，革蘭氏陽(yáng)性，兼性厭氧，具有溶血活性。該菌主要定植在動(dòng)物的皮膚、呼吸道、泌尿生殖道和胃腸道等黏膜表面，是一種內(nèi)源性、條件性致病菌。由化膿隱秘桿菌感染動(dòng)物引起的以化膿性炎癥為主的傳染病，常導(dǎo)致牛、羊、豬等多種家畜的化膿性肺炎、子宮內(nèi)膜炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎、膿腫等疾病，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)敗血癥而死亡。4.1.1普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板和生化發(fā)酵管的配制，按GB/T4789.28的要求實(shí)施。PCR相關(guān)試劑按GB/T4789.6-2003中第4章的規(guī)定準(zhǔn)備。1DB36/T1846—20234.2器材器材按GB/T4789.6-2003中3的規(guī)定準(zhǔn)備。5臨床診斷5.1流行病學(xué)該病常呈散發(fā)，不同年齡和品種的家畜均可感染，乳房炎的發(fā)生多見于炎熱的夏季，停乳期奶牛和青年母牛易感；關(guān)節(jié)炎多發(fā)于犢牛和仔豬。病原菌可通過病畜上呼吸道、乳房、外陰等的分泌物和糞便排出，直接或間接通過飲水器和其他污染物傳播；該菌還可通過打耳號(hào)、去勢(shì)等途徑感染。5.2臨床癥狀5.2.1化膿性肺炎病畜體溫升高，食欲減退，伴有咳喘、流涕、呼吸急促等呼吸道癥狀，漸進(jìn)性消瘦。5.2.2子宮內(nèi)膜炎患病母畜發(fā)情期分泌物量多、不能成拉絲狀，或量少、粘稠、渾濁。產(chǎn)后食欲不振，弓背努責(zé)，排出污紅色、粘稠的分泌物，惡臭。5.2.3化膿性乳房炎患病母畜一個(gè)或多個(gè)乳區(qū)發(fā)生炎癥和水腫，乳房分泌物變色、粘稠，呈奶油樣或漿液樣，惡臭；嚴(yán)重時(shí)乳區(qū)變松軟，膿腫向外破潰，發(fā)熱，食欲不佳，停止反芻。病畜精神沉郁，采食量下降，關(guān)節(jié)腫脹，跛行或不能站立。5.2.5皮下或肌肉膿腫剖檢可見喉頭和氣管中存在泡沫樣黏液；胸腔有膿性渾濁積液，胸膜增厚；肺部表面有黃白色膿腫或壞死灶，間質(zhì)增寬，伴有不同程度的充血、實(shí)質(zhì)性肉變。剖檢可見子宮體積增大，宮頸口不同程度的腫脹和充血，宮腔內(nèi)有膿液，子宮內(nèi)膜有糜爛或潰瘍?cè)睢?.3.3化膿性乳房炎剖檢可見乳腺組織內(nèi)有大小不等的化膿灶，彌散分布，充滿黃白色或黃綠色的膿性滲出物。5.3.4化膿性關(guān)節(jié)炎2DB36/T1846—20235.3.5皮下或肌肉膿腫剖檢可見膿腫有較厚的纖維素包膜，內(nèi)含白色或黃綠色膿汁。淋巴結(jié)膿包剖檢還可見淋巴結(jié)被大量結(jié)締組織包裹，質(zhì)地堅(jiān)硬。6病原菌的分離培養(yǎng)6.1樣品的采集、保存與運(yùn)輸分泌物、膿汁、乳汁、組織等病料樣品的采集、保存與運(yùn)輸按照NY/T541的要求執(zhí)行。6.2細(xì)菌分離培養(yǎng)6.2.1接種樣品接種在無菌條件下進(jìn)行。用消毒后的剪刀處理組織病料，露出無菌切面，用無菌接種環(huán)自切面處伸入組織內(nèi)部，劃線接種于普通瓊脂平板和鮮血瓊脂平板；液體樣品直接劃線。6.2.2菌落形態(tài)觀察接種后的平板在37℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)48h，觀察菌落特征。普通瓊脂平板上不生長(zhǎng)，鮮血瓊脂平板上形成的菌落形態(tài)單一，白色或灰白色，圓形，濕潤(rùn)，半透明，表面光滑隆起，直徑約1mm，且菌落周邊形成透明的β-溶血環(huán)，則為化膿隱秘桿菌疑似菌落。挑取符合6.2.2特征的疑似菌落，按GB4789.28中規(guī)定的方法接種生化發(fā)酵管，于37℃恒溫培養(yǎng)18h~24h。3DB36/T1846—20237.2.3結(jié)果判定若疑似菌落的生化特性與標(biāo)準(zhǔn)化膿隱秘桿菌生化特性（表1）一致，可確認(rèn)該菌為化膿隱秘桿菌。7.3PCR鑒定7.3.1模板制備細(xì)菌基因組模板的制備方法，按GB/T4789.6的規(guī)定執(zhí)行。7.3.2引物序列檢測(cè)基因是化膿隱秘桿菌保守的特異性基因plo（溶血素編碼基因）。上游引物序列：5'-GGCCCGAATGTCACCGC-3'；下游引物序列：5'-AACTCCGCCTCTAGCGC-3'。擴(kuò)增片段大小為270bp。7.3.3反應(yīng)體系每個(gè)樣品建立25μLPCR反應(yīng)體系，見表2。用化膿隱秘桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19411）的基因組作為陽(yáng)性對(duì)照，無菌雙蒸水作為陰性對(duì)照。表2化膿隱秘桿菌plo基因擴(kuò)增體系配置表試劑名稱加樣體積（μL）2×TaqPCRMasterMix上游引物（10μmol/L）下游引物（10μmol/L）DNA模板12.51預(yù)變性95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，結(jié)束反應(yīng)，4℃配制1.5%的瓊脂糖凝膠，添加工作濃度的核酸染料。取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，同時(shí)用DNAmarker作為分子量參考。用凝膠成像系統(tǒng)觀察分析電泳結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出270bp的條帶，同時(shí)陰性對(duì)照未見有PCR擴(kuò)增條帶，檢測(cè)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)與陽(yáng)性質(zhì)控同樣大小的條帶時(shí)，判為陽(yáng)性；被檢樣品未出現(xiàn)與陽(yáng)性質(zhì)控同樣大小的條帶時(shí)，判為陰性。8綜合判定符合5規(guī)定的流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化，判定為臨