1傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急處置技術規(guī)范細菌類應急檢測技術本文件適用于傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急處置中細菌類傳染病病原體的應急檢測。下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文GB19489實驗室生物安全通用要求WS233病原微生物實驗室生物安全通用準則WS288肺結核診斷下列術語和定義適用于本文件?？稍谳^短時間內確定目標區(qū)域中核苷酸的順序，用于細菌全基組或病原宏基因測的大規(guī)模并行測序注：又稱“下一代”測序技術("Next-generation"sequ4實驗室生物安全要求4.1實驗人員應根據(jù)GB19489和風險評估的要求，配備不同類型傳染病感染的個人防護裝備，包括但不限于防護服、手套、外科口罩或醫(yī)用防護口罩、防護面屏、防護帽。防護服宜每隔4h更換一次。在發(fā)4.2實驗人員、實驗場所、感染性標本處置及消毒滅菌等應符合WS233中的實驗室生物安全管理2每一批次反應過程中應至少設置一個陰性和陽性對照，必要時增加空白對照。6常用顯微鏡檢查技術其數(shù)量；觀察標本中細菌動力特征(用暗視野顯微鏡觀察)等。6.2.1直接在玻片上涂抹標本，涂片應薄且均勻。自然干燥或恒溫干燥器上干燥后，經(jīng)甲醇固定或火焰6.2.2革蘭染色脫色時間因選用不同的脫色劑而異。使用革蘭氏染色儀染色，應按照廠家操作說明書抗酸染色鏡檢操作流程應按照WS288執(zhí)行。熒光染色顯微鏡檢查步驟如下：a)染色：涂片經(jīng)火焰固定后，滴加金胺“O”染色劑蓋滿玻片，染色30min,流水自玻片一端輕緩沖d)鏡檢：玻片涂膜面向上置于熒光或LED顯微鏡載物臺，并以卡尺固定后，以低倍鏡搜索發(fā)現(xiàn)疑一般應在患者使用抗生素之前采集無菌部位標本如血液標本直接接種血培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，陽性血培養(yǎng)3非無菌部位標本，通過直接培養(yǎng)或選擇性增菌培養(yǎng)的方式，針對不同細菌采用不同培養(yǎng)基和分離程8分子生物學應急檢測技術根據(jù)標本類型選擇相應商品化離心柱法或磁珠法基因組核酸提取試劑盒。選擇非人源性內參時，待提取標本中宜加入相應的內參模板。a)取1接種環(huán)(約2μL～5μL)擴大培養(yǎng)物放入裝有500μL純水或TE的1.5mL離心管內，混勻；b)100℃加熱10min;d)吸取上清即為PCR模板。8.2.1反應體系配制(引物、鏈置換型核酸合成酶、基質、模板)后置于指定溫度下(60℃~65℃),經(jīng)一個步驟即可完成。具體參照相應細菌核酸檢測試劑盒說明書。8.3實時熒光PCR技術道)應參照相應細菌核酸檢測試劑盒說明書。b)陽性顯示Ct值小于或等于細菌核酸檢測試劑盒說明書規(guī)定值，且有S形擴增曲線。8.4.1根據(jù)PCR儀器和試劑的要求制備反應體系，將體系分配到微小分區(qū)或微滴中并封蓋，進行PCR反應。使用熒光染料或探針監(jiān)測目標核酸的擴增，配套軟件統(tǒng)計分析各反應中的陽性液滴數(shù)。48.5.1參照相應的多病原檢測試劑盒(微流體芯片法)說明書。8.5.3確定各個病原體靶點陽性擴增所對應的標本對符合要求的核酸進行文庫構建、上機測序、數(shù)據(jù)分析等。具體反應體系及反應程序參照相應測序平臺及試劑盒說明書，根據(jù)應急檢測實際選擇是否執(zhí)行去宿主操作。數(shù)據(jù)質量控制要求如下：a)標本經(jīng)過高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)，應該在去除接頭、低質量數(shù)據(jù)和宿主基因組序列后再進行下一步分析；b)測序完成后，對Q20和Q30進行統(tǒng)計，標本測序的堿基質量應同時符合：Q201≥9c)每個標本的高質量序列(Q20)數(shù)目應大于2×10?條，對于宿主含量較多而又未在核酸提取步驟進行去宿主操作的標本，數(shù)據(jù)量適當增加到4×10?~8×107條。數(shù)據(jù)質控后對標本數(shù)據(jù)進行物種注釋，宜選用得到廣泛認可的數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，包括但不限于FoodandDrugAdministrationdAtabaseforReferenceGradeDataCentreforMicroorganisms(WDCM),Geno于已知物種，數(shù)據(jù)庫中序列相似度95%以上，覆蓋度90%以上。數(shù)據(jù)質控后進行物種相對豐度計算，并記錄計算方法或軟件。除特殊方法外，應將高質量測序數(shù)據(jù)比對到組裝好的參考基因集或合適的數(shù)據(jù)庫上，按相似度95%以上，覆蓋度90%以上進行統(tǒng)計，得到基因水平上的相對豐度分布情況，再將注釋到同一物種和同一屬的分類水平的基因序列相對豐度進行疊5結果判定規(guī)則如下。a)結合《人間傳染的病原微生物目錄》或其他相關的病原微生物目錄篩選出物種注釋中的致病菌和條件致病菌的信息，針對不同標本類型并結合檢出病原微生物的種類進行解讀，確認致病微傷口)。正常有菌部位應綜合分析檢出細菌是否為導致感染的致病病原。b)對于條件致病菌3,應綜合考慮臨床表現(xiàn)和物種豐度等信息謹慎進行判斷。c)對于致病菌，當種特異性序列數(shù)較低時(小于3條)一般不考慮為致病病原，但檢出菌為敏感度較低的菌株，如結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，布魯氏菌，諾卡菌等以及烈性傳染病的時候(包括鼠疫，炭疽等),應結合臨床癥狀考慮感手段予以確認或排除。如果疑似暴發(fā)疫情標本大部分都報告相應序列且能夠排除標本之間或環(huán)境污染時即可認定其為此次疫情的致病菌。e)對于鑒定出可分離培養(yǎng)的病原菌，應按相應操作指南對原始標本進行分離培養(yǎng)。9.1.2實驗完成后按照試劑盒要求的時間觀察結果，當檢測線和質控線均為陽性結果時，判定對9.2酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)應細菌ELISA檢測試劑盒說明書。9.2.2以空白對照調零，讀取酶標儀器上各孔450nm和(或)492nm等波長的OD值，參照說明書要求酶催化底物液發(fā)光，具體流程參照相應細菌化學發(fā)光檢測試劑盒說明書。9.3.2根據(jù)化學發(fā)光試劑盒的生物參考區(qū)間判定實驗結果。每一批次化學發(fā)光實驗過程中應做質控品，或抗體結合產(chǎn)生肉眼可見凝集反應。按照試劑盒要求的時間觀察結果，出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應判為陽6[1]GB/T40226—2021環(huán)境微生物宏基因組檢測高通量測序法[2]WS271—2007感染性腹瀉診斷標準[3]WS/T498—2017細菌性腹瀉臨床實驗室診斷操作指南[4