附件6體外皮膚變態(tài)反應(yīng)ARE-Nrf2熒光素酶LuSens試驗(yàn)方法InChemicoSkinSensitisationTheARE-Nrf2LuciferaseLuSensTest1范圍本方法規(guī)定了體外皮膚變態(tài)反應(yīng)ARE-Nrf2熒光素酶LuSens試驗(yàn)的基本原理、試驗(yàn)方法和技術(shù)要求。本方法適用于化妝品用化學(xué)原料潛在致敏性的評(píng)價(jià)。2試驗(yàn)?zāi)康谋驹囼?yàn)通過檢測(cè)體外培養(yǎng)的LuSens細(xì)胞熒光素酶的表達(dá)變化，以評(píng)價(jià)受試物引起皮膚變態(tài)反應(yīng)的可能性。3定義3.175%細(xì)胞存活率濃度值theestimatedconcentrationresultingin75%cellviability（CV75）受試物染毒后，細(xì)胞存活率為75%時(shí)對(duì)應(yīng)的受試物濃度值。3.2抗氧化反應(yīng)元件antioxidantresponseelement（ARE）存在于細(xì)胞保護(hù)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，能夠響應(yīng)氧化應(yīng)激并調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的作用元件。3.3熒光素酶活性誘導(dǎo)倍數(shù)foldluciferaseactivityinduction（FoldInduction）扣除空白對(duì)照后，受試物和溶劑對(duì)照的細(xì)胞發(fā)光比值。4試驗(yàn)的基本原理致敏物質(zhì)接觸皮膚后，角質(zhì)形成細(xì)胞被激活，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及特定細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。體外培養(yǎng)含有熒光素酶報(bào)告基因的人角質(zhì)形成細(xì)胞（LuSens細(xì)胞），暴露于受試物，通過計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率和熒光素酶活性，從而預(yù)測(cè)受試物是否具有皮膚致敏性。5試驗(yàn)材料與試劑5.1細(xì)胞含有ARE熒光素酶報(bào)告基因的人角質(zhì)形成細(xì)胞株（LuSens細(xì)胞株）。5.2培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)液1：DMEM培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清，1%抗生素，0.005%的嘌呤霉素鹽酸鹽。細(xì)胞培養(yǎng)液2：DMEM培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清。細(xì)胞培養(yǎng)液3：DMEM培養(yǎng)液中加入1%胎牛血清。5.3噻唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)液稱取MTT適量，加入不含鈣鎂的磷酸鹽緩沖液（Phosphate-BufferedSaline，PBS），溶解并稀釋至5mg/mL的溶液，作為儲(chǔ)存液。工作液：取9mL細(xì)胞培養(yǎng)液3加入1mLMTT儲(chǔ)備液，臨用現(xiàn)配。5.4細(xì)胞裂解液十二烷基硫酸鈉（SDS）10g二甲基亞砜（DMSO）99.6mL冰醋酸（100%）0.4mL6試驗(yàn)方法6.1細(xì)胞培養(yǎng)LuSens細(xì)胞使用細(xì)胞培養(yǎng)液1，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞達(dá)80%~90%融合時(shí)可用于測(cè)試，傳代次數(shù)不超過15代。6.2受試物處理6.2.1溶劑：二甲基亞砜（DMSO）和細(xì)胞培養(yǎng)液3。6.2.2細(xì)胞毒性預(yù)試驗(yàn)受試物儲(chǔ)備液：采用DMSO為溶劑配制受試物儲(chǔ)備液，最大濃度為200mM，不同劑量間比值為2，一般設(shè)12個(gè)濃度。受試物工作液：采用細(xì)胞培養(yǎng)液3將儲(chǔ)備液稀釋100倍，最終測(cè)試濃度分別為0.976、1.953、3.906、7.812、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000μM。若不能得到CV75值，則重復(fù)試驗(yàn)降低最大濃度，直到得到CV75值。若2000μM濃度時(shí)仍未觀察到細(xì)胞毒性，則正式試驗(yàn)中使用2000μM為最大濃度。6.2.3正式試驗(yàn)受試物儲(chǔ)備液：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用DMSO為溶劑配制受試物儲(chǔ)備液，最大濃度為1.2×CV75（或2000μM），不同劑量間比值為1.2，共設(shè)6個(gè)濃度。受試物工作液：采用細(xì)胞培養(yǎng)3將儲(chǔ)備液稀釋100倍，最終測(cè)試濃度分別為CV75/2.074、CV75/1.728、CV75/1.44、CV75/1.2、CV75、CV75×1.2μM。6.3陽性對(duì)照溶液配制試驗(yàn)前一天，用DMSO配制12mM陽性對(duì)照物乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）的儲(chǔ)存液，試驗(yàn)時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液3稀釋至檢測(cè)濃度為120μM。6.4陰性對(duì)照溶液配制試驗(yàn)前一天，用DMSO配制500mM陰性對(duì)照物DL-乳酸的儲(chǔ)存液，試驗(yàn)時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液3稀釋至檢測(cè)濃度為5mM。6.5試驗(yàn)步驟6.5.1細(xì)胞毒性預(yù)試驗(yàn)6.5.1.1細(xì)胞接種細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合后，棄去培養(yǎng)基，用適量PBS洗2遍，胰酶-EDTA消化后加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液2，收集細(xì)胞于離心管中，800～1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5min，棄上清液后用細(xì)胞培養(yǎng)液2重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為8.3×104個(gè)/mL。96孔板中每孔加入120μL細(xì)胞懸液，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24h。6.5.1.2受試物染毒試驗(yàn)設(shè)置陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、受試物組、溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組（只加細(xì)胞培養(yǎng)液3），每組至少3個(gè)重復(fù)孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，去除培養(yǎng)基，每孔預(yù)先加入150μL細(xì)胞培養(yǎng)液3，再依次加入50μL受試物或?qū)φ杖芤海?7℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48h。6.5.1.3MTT孵育染毒結(jié)束后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入200μLMTT工作液，37℃、5%CO2孵育2h。6.5.1.4MTT檢測(cè)孵育結(jié)束后，去除MTT工作液，每孔加入100μL細(xì)胞裂解液，震搖5min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)為570nm，參考波長(zhǎng)為690nm。6.5.1.5細(xì)胞存活率（CV75）計(jì)算由得到的吸光度值，計(jì)算與溶劑對(duì)照相比細(xì)胞存活率為75%的受試物濃度。計(jì)算方法如下：選擇兩個(gè)連續(xù)濃度，一個(gè)細(xì)胞存活率大于75%，一個(gè)細(xì)胞存活率低于75%，則CV75=（Cb?Ca）Ca（μM）：細(xì)胞存活率高于75%的最大受試物測(cè)試濃度Cb（μM）：細(xì)胞存活率低于75%的最小受試物測(cè)試濃度Va：Ca對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率Vb：Cb對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率6.5.2正式試驗(yàn)6.5.2.1細(xì)胞接種細(xì)胞生長(zhǎng)至80～90%融合后，棄去培養(yǎng)基，用適量PBS洗2遍，胰酶-EDTA消化細(xì)胞后加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液2，收集細(xì)胞于離心管中，800～1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5min，棄上清液后用細(xì)胞培養(yǎng)液2重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為8.3×104個(gè)/mL。正式試驗(yàn)中，每個(gè)受試物使用一個(gè)平底透明的96孔板（用于MTT檢測(cè)），一個(gè)白色不透明的96孔板（用于LuSens檢測(cè)），96孔板中每孔加入120μL細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24h。6.5.2.2受試物染毒試驗(yàn)設(shè)置陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、受試物組、溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組（只加細(xì)胞培養(yǎng)液3），每組至少3個(gè)重復(fù)孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，去除培養(yǎng)基，每孔預(yù)先加入150μL細(xì)胞培養(yǎng)液3，再依次加入50μL受試物或?qū)φ杖芤海?7℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48h。6.5.2.3MTT孵育染毒結(jié)束后，透明96孔板中去除培養(yǎng)基，每孔加入200μLMTT工作液，37℃、5%CO2孵育2h。6.5.2.4MTT檢測(cè)孵育結(jié)束后，去除培養(yǎng)液，每孔加入100μL細(xì)胞裂解液，震搖5min，酶標(biāo)儀檢測(cè)，吸收波長(zhǎng)為570nm，參考波長(zhǎng)為690nm。6.5.2.5熒光素酶表達(dá)檢測(cè)染毒48h后，白色96孔板中去除培養(yǎng)基，每孔加入300μLPBS（含鈣鎂）洗滌2遍后，按照熒光素酶報(bào)告基因檢驗(yàn)檢測(cè)試劑盒要求檢測(cè)熒光素酶表達(dá)。6.5.2.6結(jié)果計(jì)算誘導(dǎo)倍數(shù)=Lsample：受試孔的熒光讀數(shù)Lblank：不包含細(xì)胞和給予受試物的空白孔的熒光讀數(shù)Lsolvent：包含細(xì)胞和溶劑對(duì)照孔的熒光讀數(shù)7結(jié)果評(píng)價(jià)7.1試驗(yàn)成立的條件與溶劑對(duì)照相比，陽性對(duì)照組誘導(dǎo)倍數(shù)（FoldInduction）≥2.5，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且細(xì)胞存活率≥70%。與溶劑對(duì)照相比，陰性對(duì)照組誘導(dǎo)倍數(shù)（FoldInduction）＜1.5。所有溶劑對(duì)照組細(xì)胞存活率SD值＜20%。正式試驗(yàn)中，受試物至少有3個(gè)測(cè)試濃度細(xì)胞存活率＞70%。7.2結(jié)果判定與溶劑對(duì)照組相比，當(dāng)受試物至少有一個(gè)測(cè)試濃度細(xì)胞毒性＜70%（或者最大無細(xì)胞毒性測(cè)試濃度達(dá)到2000μM），且平均誘導(dǎo)倍