GB/T14926—××××實驗動物漢坦病毒檢測方法本文件規(guī)定了漢坦病毒（HV）的抗體和核酸檢測方法、試劑等。本文件適用于小鼠、大鼠等實驗動物HV的檢測?；?qū)嶒灲臃N物、實驗動物環(huán)境樣本和動物源性生物制品中漢坦病毒的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本適用于本文件。GB/T14926.50實驗動物酶聯(lián)免疫吸附試驗GB/T14926.52實驗動物免疫熒光試驗GB19489GB19489GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求3原理3.1抗體檢測原理根據(jù)免疫學(xué)原理，采用HV抗原檢測小鼠、大鼠血清中的HV抗體。3.2核酸檢測原理針對漢坦病毒M片段基因設(shè)計特異的引物序列，通過RT-PCR對模板RNA進行擴增，根據(jù)RT-PCR檢測結(jié)果判定該樣品中是否含有漢坦病毒，套式PCR引物中的內(nèi)引物可用于病毒分型。實時熒光定量PCR方法是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，加入了一條特異性的熒光探針，探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，淬滅作用消失，熒光信號產(chǎn)生并被檢測儀器接受，隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)進行，PCR產(chǎn)物與熒光信號的增長呈對應(yīng)關(guān)系。因此，可以通過檢測熒光信號對核酸模板進行檢測。4主要試劑和器材4.1試劑：4.1.1ELISA抗原4.1.1.1特異性抗原在生物安全柜內(nèi)，用Hantaan型或Seoul型毒株感染的E6細胞，當特異性熒光達到+++時，即可收獲培養(yǎng)物。經(jīng)β丙內(nèi)酯滅活并凍融三次或超聲波處理后，低速離心去除細胞碎片，上清液再經(jīng)超速離心濃縮后制成ELISA抗原。1.14.1.1.2正?？乖璄6細胞凍融破碎后，經(jīng)低速離心去除細胞碎片而獲得的上清液。4.1.2抗原片在生物安全柜內(nèi)，用Hantaan型或Seoul型毒株感染的E6細胞，每2~3天更換維持液，培養(yǎng)7~10d，用IFA法測定細胞內(nèi)特異性熒光，當熒光達到+++時，將細胞用胰酶分散，用PBS洗滌，涂片，室溫干燥的同時，在紫外線下20cm處照射30min，冷丙酮固定10min，-20°C保存。4.1.3陽性血清免疫SPF小鼠或大鼠所獲得的抗血清。4.1.4陰性血清SPFSPF小鼠或大鼠血清。4.1.5酶結(jié)合物辣根過氧化物酶標記羊或兔抗小鼠、大鼠IgG抗體。用于檢測相應(yīng)動物血清抗體；辣根過氧化物酶標記葡萄球菌蛋白A（SPA）,用于檢測小鼠血清抗體。4.1.6熒光標記物異硫氰酸熒光素標記羊或兔抗小鼠、大鼠異硫氰酸熒光素標記羊或兔抗小鼠、大鼠IgG抗體用于檢測相應(yīng)動物血清抗體。4.1.7核酸檢測試劑4.1.7.1經(jīng)DEPC處理的無核酸酶水。4.1.7.2市售病毒RNA提取試劑盒。4.1.7.3市售商品化實時熒光定量RT-PCR基礎(chǔ)反應(yīng)液。4.1.7.4陽性對照：為滅活的含有漢坦病毒的組織樣本或細胞培養(yǎng)物。4.1.7.5陰性對照：為不含漢坦病毒的細胞培養(yǎng)物的組織樣本。4.1.7.6根據(jù)表1和表2的序列合成引物和探針，并配制成10μmol/L儲備液，-20℃保存。產(chǎn)物大小/bp②探針也可選用具有與FAM、HEX和BHQ2相同檢測效果的其他合適的熒光報告基團和熒光淬滅基團組合。4.2器材4.2.1酶標儀。4.2.14.2.2熒光顯微鏡。4.2.24.2.3普通顯微鏡。4.2.34.2.437℃培養(yǎng)箱或水浴箱。4.2.5實時熒光PCR儀。4.2.54.2.6PCR儀。4.2.7電泳儀4.2.8凝膠成像分析系統(tǒng)5檢測方法5.1采用ELISA方法（見GB/T14926.50）進行血清學(xué)檢測。5.2采用IFA方法（見GB/T14926.52）進行血清學(xué)檢測。5.3采用普通RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR方法（見附錄A）進行漢坦病毒核酸檢測。6結(jié)果判定對陽性檢測結(jié)果，選用同一種方法或另一種方法復(fù)檢。如仍為陽性則判為陽性。7結(jié)果報告根據(jù)判定結(jié)果，出具報告。（規(guī)范性附錄）實驗動物漢坦病毒核酸檢測方法A.1主要設(shè)備和材料A.1.1實時熒光PCR儀A.1.2PCR儀。A.1.4凝膠成像分析系統(tǒng)。A.1.5Nanodrop紫外分光光度計。A.1.6高速冷凍離心機A.1.7臺式離心機。A.1.8恒溫孵育器。A.1.9漩渦振蕩器。A.1.10組織勻漿器或手持式均質(zhì)器。A.1.11生物安全柜。A.1.12PCR工作臺。A.1.13-80℃冰箱，-20℃冰箱，2~8℃冰箱。A.1.14微量移液器（10μL，100μL，1000μLA.1.15無RNase和DNase的離心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL無RNase和DNase的吸頭（10μL，200μL，1mL無RNase和DNase的PCR擴增反應(yīng)管。A.2試劑除特別說明外，以下實驗用試劑均為分析純；實驗用水為去離子水。A.2.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H20）27.6g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.1.2B液0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉NaH2PO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g），先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.1.30.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制取A液14mL，B液36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g，加800mL去離子水溶解稀釋，用HCl調(diào)pH至7.2，最后定容至1000mL，經(jīng)121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.2.2無DNase/RNase去離子水實驗用去離子水按體積比0.1%加入DEPC搖勻，室溫靜置過夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.2.3RNA抽提試劑TRIzol或其他等效產(chǎn)品。A.2.4無水乙醇。A.2.575%乙醇（無DNase/RNase去離子水配制）。A.2.6三氯甲烷（氯仿）。A.2.7異丙醇。A.2.8逆轉(zhuǎn)錄試劑A.2.9PCR試劑：rTaq酶、10×PCRBuffer、dNTP。A.2.10DNA分子質(zhì)量標準。A.2.11TAE電泳緩沖液A.2.11.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2·H2O）滅菌去離子水5mol/L氫氧化鈉溶液滅菌去離子加至100mL，121℃,15min滅菌備用。A.2.11.250×TAE電泳緩沖液配制羥基甲基氨基甲烷(Tris)冰乙酸0.5mol/LEDTA溶液，pH8.0滅菌去離子加至1000mL，121℃,15min滅菌備用。用時用滅菌去離子水稀釋至l×使用。A.2.12溴化乙錠：10mg/mL溴化乙錠滅菌去離子水A.2.131.5%瓊脂糖凝膠瓊脂糖18.61g80mL調(diào)pH至8.0242gl00mL200mg20mL1×TAE電泳緩沖液加至l00mL混合后加熱至完全融化,待冷至50℃~55℃時，加溴化乙錠(EB)或其他等效核酸染料，輕輕晃動搖勻后將瓊脂糖溶液倒入電泳板制成凝膠。A.2.14一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR試劑盒或等效試劑盒。A.2.15引物和探針：根據(jù)表1和表2的序列合成引物和探針，引物和探針加無RNase去離子水分別配制成20μmol/L儲備液，-20℃保存。A.3采樣及樣本的處理采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣及樣本前處理過程中須戴一次性手套A.3.1臟器組織剖檢，無菌采集動物肺臟和脾臟，剪取待檢樣本2.0g于無菌5mL離心管，加入4mL滅菌PBS，使用電動勻漿器充分勻漿1~2min，然后將組織懸液在4℃、3000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號備用。A.3.2細胞培養(yǎng)物方法一：直接刮取樣本接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細胞培養(yǎng)物于15mL離心管中，3000r/min離心10min，去上清，加1mL滅菌PBS重懸細胞，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌1.5mL離心管中，編號備用。方法二：將樣本接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，細胞混懸液轉(zhuǎn)移于15mL離心管中，12000r/min離心10min，去細胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到無菌15mL離心管中，編號備用。A.3.3實驗動物環(huán)境A.3.3.1實驗動物飼料、墊料和飲水取適量實驗動物飼料和墊料置于聚乙烯薄膜袋中，加入適量滅菌PBS(飼料和墊料需全部浸泡于液體中)。密封后浸泡5~10min，充分混勻，將混懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，4℃、12000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號備用。取適量實驗動物飲水直接轉(zhuǎn)移到無菌5mL離心管中，編號備用。A.3.3.2實驗動物設(shè)施設(shè)備用滅菌棉拭子拭取實驗動物設(shè)施設(shè)備出風(fēng)口初效濾膜表面沉積物，將拭子置入滅菌15mL離心管，加入適量滅菌PBS，浸泡5~10min，充分混勻，取出棉拭子，將離心管于4℃、12000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號備用。A.3.4樣本的存放采集或處理的樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h，若需長期保存，須放置-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(凍融不超過3次)。A.4病毒核酸提取選擇市售商品化RNA提取試劑盒。按照試劑盒操作說明書提取樣品中的RNA。在提取RNA時應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照樣品，按同樣方法提取RNA。RNA的提取操作應(yīng)在生物安全柜中進行，避免RNA氣溶膠的污染。制備好的RNA應(yīng)盡快進行下一步PCR反應(yīng)，若暫時不能進行PCR反應(yīng)，應(yīng)于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩.5普通RT-PCRA.5A.5.1第一輪RT-PCRA.5.1.1RT-PCR反應(yīng)體系第一輪RT-PCR反應(yīng)體系見表3。反應(yīng)液的配制在冰浴上操作，每次反應(yīng)同時設(shè)計陽性對照、陰性對照和空白對照，其中陽性對照以含有HV的組織或培養(yǎng)物提取的DNA作為陽性對照模板，其中陰性對照以不含有HVDNA樣本（可以是正常動物組織或正常培養(yǎng)物）作為陰性對照模板，空白對照即為不加模板對照（NoTemplateControl，NTC即在反應(yīng)中用水來代替模板。2229A.5.1.2RT-PCR反應(yīng)參數(shù)RT-PCR反應(yīng)參數(shù)見表4。111注：可使用其他等效的一步法或兩步法RT-PCR檢測試劑盒進行，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)可進行相應(yīng)調(diào)整。A.5.2第二輪RT-PCR取第一輪RT-PCR的擴增產(chǎn)物10μL作為模板，分別采用漢灘型和漢城型兩對型特異性引物，參照7.4.1第一輪RT-PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)(省去逆轉(zhuǎn)錄步驟)進行第二輪PCR擴增。A.5.3PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測和拍照將適量50×TAE稀釋成1×TAE溶液，配制含核酸染料溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μLPCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，以DNA分子質(zhì)量作為參照。電壓大小根據(jù)電泳槽長度來確定，一般控制在3~5V/cm，當上樣染料移動到凝膠邊緣時關(guān)閉電源。電泳完成后在凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄電泳結(jié)果。A.5.4RT-PCR結(jié)果判定A.5.4.1質(zhì)控標準A.5.4.1.1第一輪RT-PCR反應(yīng)(外引物)中，陰性對照和空白對照未出現(xiàn)條帶，陽性對照出現(xiàn)預(yù)期大小(464bp)的擴增條帶則表明反應(yīng)體系運行正常。A.5.4.2第一輪RT-PCR反應(yīng)(外引物)中，陰性對照和空白對照未出現(xiàn)條帶，陽性對照也未出現(xiàn)預(yù)期大小(464bp)的擴增條帶。但是第二輪PCR反應(yīng)(基因型鑒別引物)中一對引物的陽性對照出現(xiàn)預(yù)期大小(383bp或418bp)的擴增條帶則表明反應(yīng)體系運行正常，且陰性對照和空白對照未出現(xiàn)目的條帶。A.5.4.3符合上述兩種情況之一，即可進行結(jié)果判定；否則此次試驗無效，需重新進行普通PCR擴增。A.5.4.4結(jié)果判定A.5.4.4.1樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察到383bp擴增條帶，判為漢灘型漢坦病毒核酸陽性。A.5.4.4.2樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察到418bp擴增條帶，判為漢城型漢坦病毒核酸陽性。A.5.4.4.3樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上均未觀察到383bp和418bp擴增條帶，判為漢坦病毒核酸陰性。A.6實時熒光定量RT-PCRA.6.1實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系見表5。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時設(shè)計陽性對照、陰性對照和空白對照，其中陽性對照以含有HV的組織或細胞培養(yǎng)物提取的DNA作為陽性對照模板，其中陰性對照以不含有HVDNA樣本(可以是正常動物組織或正常細胞培養(yǎng)物)作為陰性對照模板，空白對照即為不加模板對照(NoTemplateControl，NTC)，即在反應(yīng)中用水來代替模板。1111111116注：試劑Rox只在具有Rox熒光校正通道的實時熒光PCR儀上進行擴增時添加，否則用水補齊。PCR反應(yīng)體系也可以根據(jù)不同市售商品化實時熒光定量售商品化實時熒光定量RT-PCR基礎(chǔ)反應(yīng)液的說明書進行配置。A.6.2實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)見表6。否11是注：注：PCR反應(yīng)參數(shù)也