第2節(jié)基因工程的基本操作程序

第1課時(shí)目的基因的篩選與獲取和基因表達(dá)載體的構(gòu)建

課標(biāo)內(nèi)容(1)闡明基因工程的原理和基本操作程序。

(2)嘗試進(jìn)行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物。

一?自主梳理?

知識(shí)點(diǎn)1目的基因的篩選與獲取

1.培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的四個(gè)步驟

(1)目的基因的篩選與獲取。

⑵基因表達(dá)載體的構(gòu)建。

(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。

(4)目的基因的檢測(cè)與鑒定。

2.篩選合適的目的基因

廠屯門在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變

設(shè)一受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等

［囚J的基因，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因

篩選目從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因

的基因「中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一

3.獲取目的基因的方法

人工合成目的基因

常用小旦特異性地快速擴(kuò)增目的基因

'通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因

4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因

(l)PCR的含義：PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫,它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制

的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核背

酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。

(2)基本條件

DNA母鏈

便移14種脫氧核甘酸

途〉耐高溫的DNA聚合酶

閨%V使DNA聚合酶能夠從引物的￡端開始

也多片連接脫氧核昔酸

(3)過程

基于PCR的過程，完成下列問題:

,5'...............................

IIIIIIIIIIIIIIII

待擴(kuò)增的DNA片段

飛....“

冊(cè)

過程I為變性,該階段的溫度為卻，以上，目的是使雙鏈DNA解聚為單鏈。

過程n為復(fù)性,該階段的溫度為為左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條

單鏈DNA結(jié)合。

過程HI為延伸,該階段的溫度為72—g左右，該過程需要在耐高溫的DNA聚合

鱉的催化下，利用4種脫氧核甘酸為原料,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則從子鏈的支端

延伸合成新的子鏈DNA。

(4)儀器：PCR擴(kuò)增儀(RCR儀)。

(5)PCR產(chǎn)物的鑒定方法：瓊脂糖凝膠電泳。

知識(shí)點(diǎn)2基因表達(dá)載體的構(gòu)建

1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的

⑴使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且遺傳給下一代。

(2)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。

2.基因表達(dá)載體的組成

位置：目的基因的上游

功能.(RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位

JI驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄

廣-------------------------------

啟為子/目的基因：人們所需要的基因

終

止;位置：目的基因的下游

表達(dá)載體子

復(fù)以】功能：終止轉(zhuǎn)錄

原點(diǎn)

標(biāo)記基因:便于重組DNA分

子的篩選

3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程

(1)首先用一定的限制酶切割載體。

(2)然后用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。

(3)再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處(如圖所示)。

夕卜1原DNA

限制晦

兩個(gè)切口，獲

一個(gè)切口，、DNA連接酶

取目的基因

兩個(gè)黏性末端

基因表達(dá)載體

度自查自糾,

⑴從已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選目的基因是獲取目的基因的一種有效方

法。(V)

(2)Taq酶是用PCR儀對(duì)DNA分子擴(kuò)增過程中常用的一種耐高溫的DNA連接酶。

(X)

提示：酶是耐高溫的DNA聚合酶。

(3)基因表達(dá)載體中啟動(dòng)子是DNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位。(X)

提示：?jiǎn)?dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位。

(4)PCR擴(kuò)增技術(shù)中，需用解旋酶使雙鏈DNA解聚。(X)

提示：不需要解旋酶。

(5)DNA聚合酶能夠從引物的5,端開始連接脫氧核甘酸。(X)

提示：3'端。

-?合作探究?

一、利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因

【情境探疑】

圖1、圖2分別是PCR擴(kuò)增技術(shù)相關(guān)過程，請(qǐng)思考回答下列問題:

|變性

|復(fù)性

第一輪循環(huán)

弓I物B

innnnnf引物A

111$

*11111111111111111111111111111111111111111111111,-

|變性

圖1

第1組(引物I?1"I-I-I~I~I

引物［引物n■CAGGAT

~1-I-I-I-I-I

ATCCTG

第2組(引物i'?n~?~?~?~??~?~?~?~r

引物［引物n：AACTGCAGTT

"i~i-i_i_ii-i-i_i~r

CGACTGATTA

圖2

⑴請(qǐng)完善圖1中的信息。

(2)高溫變性的目的是使雙鏈DNA解聚為單鏈。

(3)PCR所需引物是依據(jù)目的基因的一段已知序列設(shè)計(jì)而成的,圖1中引物A與

引物B不同(填“相同”或“不同”)，其在PCR過程中丕能(填“能”或“不能”)

重復(fù)利用。

(4)DNA復(fù)制時(shí)為什么需要引物？

提示：在DNA擴(kuò)增時(shí)，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從引物的3,

端延伸DNA鏈，因此DNA復(fù)制時(shí)應(yīng)加入兩種引物。

(5)圖1所示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，從第幾輪循環(huán)才會(huì)產(chǎn)生完整的目的基

因(可用相關(guān)圖解解釋)？

提示：第3輪，如圖所示：

——完整的

—目的基因

——完整的

一目的基因

第1輪第2輪第3輪

(6)圖2是某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理，請(qǐng)分別說明

理由。

提示：第1組：引物I和引物n局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。第2組：引物I，

自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。

(7)要保證目的基因能與載體相連接，還要對(duì)引物進(jìn)行什么操作？

提示：要在兩種引物的5,端分別添加上限制酶的識(shí)別序列。

(8)如果循環(huán)〃次，則共需消耗多少對(duì)引物？

提示：共需消耗(2〃一1)對(duì)引物。

國歸納提升

L引物

DNA復(fù)制時(shí)，DNA聚合酶不能從DNA模板鏈的一端直接開始合成子鏈，而是需

要從引物的3,端開始連接脫氧核甘酸，形成DNA子鏈。因此進(jìn)行PCR擴(kuò)增的前

提是栗有一段已知目的基因的核甘酸序列來合成引物。

(1)引物的本質(zhì)：引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈

核酸，既可以是DNA單鏈，也可以是RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，

也需栗引物，一般是RNA片段。

(2)引物的長度：用于PCR的引物長度通常為20?30個(gè)核苜酸。

⑶一個(gè)PCR反應(yīng)所需引物的種類：2種。DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模?種弓I物

要分別與兩條模板鏈結(jié)合。

2.PCR所需栗的原料

在PCR過程中實(shí)際加入的為dNTP,即脫氧核糖核甘三磷酸，包括dATP、dGTP、

dTTP、dCTPo其分子結(jié)構(gòu)為：

中~中~魯r2^^3（A、G、C、T）

脫氧核糖

既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。

3.生物體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的比較

，PCR技術(shù).‘DNA復(fù)制：

慳必昱作用下厥解旋酶催;

變性解砒.［方式J

細(xì)胞外（在PCR擴(kuò)增r—.內(nèi)（主要在細(xì)胞

儀內(nèi)）?但曳?核內(nèi)）

“吉PMnNTA取入DNA解旋酶、普通的

耐圖溫的DNA聚合.|酶1DNA喂公酶等

酶（TagDNA聚合酶）DNA兼口悔寺

分別從兩條鏈的引rXn晶般金上二N

物的3,端開始延伸，，制臀；

都是連續(xù)合成華鏈不連續(xù)合成，再由

取DNA連接酶連接

3cm--------------5'I八3'

5，「山?；亙；,父：

變性一復(fù)性一延伸,邊解旋，邊上制

兩個(gè)引物之間的旦完整DNA

DNA片段'-----1

1

需控制溫度，在較叵國別哈*一。心攵在

高溫度下進(jìn)行.條件,細(xì)胞內(nèi)溫和條件

【典例應(yīng)用】

例1下列有關(guān)體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)比較的敘述，錯(cuò)誤的是（）

A.二者子鏈的延伸方向相同，均為5,端一3,端

B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實(shí)現(xiàn)解旋

C.體內(nèi)DNA復(fù)制需要能量，PCR反應(yīng)也需要能量

D.二者遵循的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則相同

答案B

解析DNA體內(nèi)復(fù)制與利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，子鏈的延伸方向相同，均為

5,端一3,端，A正確；PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，在高溫條件下氫

鍵斷裂，B錯(cuò)誤；DNA體內(nèi)復(fù)制與利用PCR擴(kuò)增DNA時(shí)都需要能量，但兩者所

需能量來源不同，C正確；DNA體內(nèi)復(fù)制與利用PCR擴(kuò)增DNA時(shí)，遵循的堿基

互補(bǔ)配對(duì)原則相同，D正確。

例2(2023?山東濟(jì)寧高二檢測(cè))通過咽拭子取樣進(jìn)行RT-PCR技術(shù)檢測(cè)是臨床上

診斷新冠病毒感染疑似患者的常用方法，用于核酸檢測(cè)的RT-PCR試劑盒的部

分工作原理簡(jiǎn)圖如圖所示：

含病毒樣本裂解病毒RNART-PCR

(痰、鼻咽拭子)怎審*

(l)RT-PCR是指以病毒的RNA為模板通過_______過程合成cDNA,并對(duì)cDNA

進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過程。利用RT—PCR試劑盒對(duì)新冠病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，除借助上

述RT-PCR技術(shù)外，還需要有特異性探針，利用該探針對(duì)新冠病毒進(jìn)行核酸檢

測(cè)方法是。若用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增胰島素基因，應(yīng)選擇

細(xì)胞提取RNAo

(2)PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制相比，不需要酶。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

的前提是.0

(3)若將1個(gè)DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入個(gè)引物。

(4)PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、_______三步，其中復(fù)性的結(jié)果是

__________________________________________________________________________O

答案(1)逆轉(zhuǎn)錄PCR等技術(shù)胰島B(2)解旋有一段已知目的基因的核昔

酸序列作為模板，以便合成引物(3RU—2(4)延伸兩種引物通過堿基互補(bǔ)配

對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合

解析(1)以RNA為模板合成cDNA的過程為逆轉(zhuǎn)錄過程，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶

的參與；探針是指被放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記的一段單鏈核酸，因此制作該

探針的依據(jù)是新冠病毒的核甘酸序列，利用該探針對(duì)新冠病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法是

PCR等技術(shù)。PT—PCR技術(shù)首先是以RNA為模板合成cDNA,因此應(yīng)選擇胰島

B細(xì)胞提取RNAo

(2)PCR技術(shù)是利用DNA在高溫條件下解開雙鏈，因此與體內(nèi)DNA復(fù)制相比，

不需要解旋酶。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提是有一段已知目的基因的核昔

酸序列作為模板，以便根據(jù)這一序列合成引物。

(3)PCR技術(shù)大量擴(kuò)增目的基因時(shí)，緩沖液中需要加入的引物個(gè)數(shù)即為新增單鏈數(shù)

=22n—2,因此，若將1個(gè)DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入

2.210—2=2"—2個(gè)引物。(4)PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三

步，其中復(fù)性的結(jié)果是兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。

境題后反思

用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？

提示：mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。由mRNA

逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過程是：①逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的

DNA鏈，形成RNA—DNA雜交分子。②用一定的方法降解RNA—DNA雜交分

子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA,即cDNA。

二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

【情境探疑】

目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，需構(gòu)建基因表達(dá)載體，圖甲、乙表示質(zhì)粒及目的基

因所在DNA片段，圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的切割位點(diǎn)。

EcoRI目的基因EcoRI

llllllllllllllllllMlllllllllllllllllllll夕卜源DNA

1I

Ba777HISmaIHindHI

乙

(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要使用的工具酶為限制酶和DNA連接酶。

(2)用圖中質(zhì)粒和DNA構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，不能使用SmaI切害U，原因是SmaI

會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因。

(3)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，可用EcoRI同時(shí)切割質(zhì)粒和DNA,但會(huì)導(dǎo)致目的基因

和質(zhì)粒的自身環(huán)化、目的基因不能定向連接等問題,為避免以上問題出現(xiàn)，應(yīng)使

用BamHI和印“dill(或EcoRI和HindHI)兩種限制酶。

(4)構(gòu)建好的基因表達(dá)載體在目的基因前要加上啟動(dòng)壬，其是RNA聚合酶識(shí)別和

結(jié)合的部位。

厘歸納提升

限制酶的選擇技巧

PstISmaIPst1

LI_i

I抗病基因I

SmaIEcoRI

甲乙

⑴根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類

①應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PS/IO

②不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaIo

③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目

的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstI和EcoRI兩種限制酶（但要確保質(zhì)粒上

也有這兩種酶的切割位點(diǎn)）。

（2）根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類

;其切割位點(diǎn)11其會(huì)破壞啟動(dòng)：

，不在啟動(dòng)子,XhoI；子，不宜選擇，

［與終止子之:'一

其

位于

洞，不宜選擇，HindJR

動(dòng)

啟

子

后動(dòng)子NdeI'止

終

子

抗生素XbaI間

之

擇

Pst1抗性基因終止附BamHl選

宜

一

子一

山友位于加6EcoRI」

記基因中，：一

［其會(huì)破壞終止：

不宜選擇；

:子，不宜選擇，

;復(fù)制原點(diǎn)被破壞后，目的基因不；

〔能在受體細(xì)胞中復(fù)制，不宜選擇）

（3）根據(jù)Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶，下圖中甲、乙、丁的Ti質(zhì)粒均不宜選

取，而丙的Ti質(zhì)粒宜選取（設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaI和SacI）。

T-DNAT-DNA

切割位點(diǎn)不位于T-DNA上

XbaISacIXbaIXbaI

丙\

切割位點(diǎn)位于T二DNA上，切割位點(diǎn)雖

而且含XbaI、SacI兩種在T—DNA上，

切割位點(diǎn)，恰與目的基因但缺乏SacI

兩端的切割位點(diǎn)相同的切割位點(diǎn)

【典例應(yīng)用】

例3（多選）某實(shí)驗(yàn)小組利用下圖所示的質(zhì)粒和目的基因來構(gòu)建基因表達(dá)載體，將

目的基因?qū)氪竽c桿菌細(xì)胞并表達(dá)。下列敘述正確的是（）

氨節(jié)青霉素抗性基因

酶A酶A酶C

I_

酶

pBR322Bt）

酶A

酶B目的基因

7酶C

啟動(dòng)子四環(huán)素

抗性基因

A.圖中的質(zhì)粒用酶A切割后，會(huì)產(chǎn)生4個(gè)游離的磷酸基團(tuán)

B.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用酶A和酶C切割質(zhì)粒和目的基因

C.成功導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌可在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長

D.若用酶B和酶C切割，可以避免質(zhì)粒的自身環(huán)化

答案AD

解析限制酶每一次切割后會(huì)得到兩個(gè)黏性末端，會(huì)有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，而

圖中的質(zhì)粒含有2個(gè)酶A的切割位點(diǎn)，則會(huì)產(chǎn)生4個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，A正確；

在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用酶B和酶C切割質(zhì)粒和目的基因，假如用酶A切割質(zhì)

粒會(huì)破壞兩個(gè)標(biāo)記基因，B錯(cuò)誤；用酶B和酶C切割質(zhì)粒時(shí)四環(huán)素抗性基因被破

壞，成功導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌可在含氨芾青霉素的培養(yǎng)基中生長，C錯(cuò)誤；

用酶B和酶C兩種限制酶切割可以避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和兩者之間的反

向連接等問題，D正確。

例4（2023?天津?yàn)I海新區(qū)期末）下列關(guān)于基因表達(dá)載體構(gòu)建的敘述，錯(cuò)誤的是

（）

A.啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，組成它的基本單位是脫氧核昔酸

B.基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止密碼子、標(biāo)記基因等組件

C.人工構(gòu)建的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可激活或抑制目的基因的表達(dá)

D.由于受體細(xì)胞不同，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也有所差別

答案B

解析啟動(dòng)子在基因的首段，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，組成它的基

本單位是脫氧核甘酸，A正確；基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終

止子、標(biāo)記基因等組件，B錯(cuò)誤；人工構(gòu)建的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，

可激活或抑制目的基因的表達(dá)，C正確；由于受體細(xì)胞有植物、動(dòng)物以及微生物

之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此基因表達(dá)載體的構(gòu)建是不完

全相同的，D正確。

例5（2023?天津?yàn)I海新區(qū)高二期末）基因工程中，需使用特定的限制性內(nèi)切核酸酶

切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。已知限制性內(nèi)切核酸酶I的識(shí)別序列和

切割位點(diǎn)是一G^GATCC—,限制性內(nèi)切核酸酶H的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)是

—*GATC—,根據(jù)圖示分析下列敘述正確的是（）

GGATCC目的基因GATC

liwiii血iwiiliHi-

CCTAGGCTAG

注：GeneI和GeneH表示兩種標(biāo)記基因

。表示限制酶僅有的識(shí)別序列放大

A.質(zhì)粒用限制性內(nèi)切核酸酶n切割，目的基因用限制性內(nèi)切核酸酶I切割

B.用限制性內(nèi)切核酸酶切割獲得目的基因時(shí)，有四個(gè)磷酸二酯鍵被水解

c.限制性內(nèi)切核酸酶I和限制性內(nèi)切核酸酶n切割后獲得的黏性末端不同

D.質(zhì)粒中標(biāo)記基因的作用是便于篩選出目的基因已經(jīng)表達(dá)的細(xì)胞

答案B

解析限制性內(nèi)切核酸酶n能識(shí)別限制性內(nèi)切核酸酶I的識(shí)別序列，限制性內(nèi)切

核酸酶I不能識(shí)別限制性內(nèi)切核酸酶n的識(shí)別序列；要將目的基因從該DNA鏈

中提取出來，需要在目的基因左右切開，所以要用限制性內(nèi)切核酸酶n；質(zhì)粒不

能用限制性內(nèi)切核酸酶n,若用該酶切割，質(zhì)粒的兩個(gè)標(biāo)記基因均被破壞，A錯(cuò)

誤；由于DNA是雙鏈，用限制性內(nèi)切核酸酶n將目的基因左右切開時(shí)，有四個(gè)

磷酸二酯鍵被水解，B正確；限制性內(nèi)切核酸酶I和限制性內(nèi)切核酸酶n切割產(chǎn)

生的黏性末端相同，c錯(cuò)誤；質(zhì)粒中標(biāo)記基因的作用是用來篩選含有目的基因的

受體細(xì)胞的，D錯(cuò)誤。

課堂小結(jié)?-

思維導(dǎo)圖晨讀必背

LPCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，該技

術(shù)的原理是DNA半保留復(fù)制。

2.PCR反應(yīng)進(jìn)行的條件有緩沖溶液、

人工合成目的基因

DNA模板、2種引物、4種脫氧核昔酸、

目的基因的:通過構(gòu)建基因文庫獲取目的基因

篩選與獲取

,利用小區(qū)獲取和擴(kuò)增目的基因耐高溫的DNA聚合酶、溫度條件等。

3.PCR擴(kuò)增的過程：變性一復(fù)性一延伸。

而菽」啟動(dòng)子、目的基因、終

（闞匹L止子、標(biāo)記基因等

基因表達(dá)載4.在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，首先會(huì)用一

體的構(gòu)建\杓建］限制酶切割、DNA連

1-----接酶連接定的限制酶切割載體，然后再用同種限

制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含

有目的基因的DNA片段；再利用DNA

連接酶連接形成重組DNA分子。

隨堂檢測(cè)

1.下列關(guān)于PCR反應(yīng)體系中所加物質(zhì)作用的敘述，錯(cuò)誤的是（）

A.耐高溫的DNA聚合酶用于催化DNA子鏈的合成

B.引物使TaqDNA聚合酶能從引物的5,端延伸DNA鏈

C.目標(biāo)DNA的雙鏈用作合成DNA復(fù)制的模板

D.四種脫氧核甘酸為PCR提供原料

答案B

解析通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要用耐高溫的DNA聚合酶催化單個(gè)脫

氧核甘酸聚合形成DNA子鏈，A正確；在復(fù)制時(shí)，引物與DNA母鏈通過堿基互

補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，ThqDNA聚合酶從引物的3,端開始延伸DNA鏈，因此DNA合成

方向總是從子鏈的5,端向3,端延伸，B錯(cuò)誤；PCR技術(shù)的原理是DNA半保留復(fù)

制，DNA復(fù)制時(shí)兩條鏈均作為復(fù)制的模板，C正確；DNA合成的原料是四種脫

氧核甘酸，D正確。

2.如圖是基因工程中基因表達(dá)載體的模式圖，若結(jié)構(gòu)X是表達(dá)載體所必需的，則

X最可能是（）

x目的基因

終止子

抗生素抗

性基因

復(fù)制原點(diǎn)

A.目的基因插入位點(diǎn)B.啟動(dòng)子

C.標(biāo)記基因D.DNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)

答案B

解析基因表達(dá)載體由啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)和目的基因等組成。

題圖中有終止子、標(biāo)記基因（抗生素抗性基因）、目的基因、復(fù)制原點(diǎn)等，還缺少

啟動(dòng)子。啟動(dòng)子位于基因的上游，所以X最可能是啟動(dòng)子，B正確。

3.在核酸分子雜交技術(shù)中，常常使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針（探針是指

以放射性同位素、生物素或熒光染料等進(jìn)行標(biāo)記的已知核昔酸序列的核酸片段）。

為了獲得B鏈作探針，可應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)選擇的引物種類是（）

A鏈

引物1引物2

引，物33,引物4

B鏈

A.引物1與引物2B.引物3與引物4

C.引物2與引物3D.引物1與引物4

答案C

解析要獲得B鏈，根據(jù)PCR中子鏈延伸方向?yàn)橄Φ?、則需選擇引物2與引物

3進(jìn)行擴(kuò)增，故選C。

4.（2023?海南中學(xué)高三一模）PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，下圖表示PCR的過程,

下列敘述錯(cuò)誤的是（）

引物a

1

90t50t72

AB|C

引向兩個(gè)分子

DNA樣品bDNA

A.反應(yīng)體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶，該酶在B過程起作用

B.引物a和引物b的長度應(yīng)適宜，且相互之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)

C.PCR是體外進(jìn)行的DNA擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增遵循DNA半保留復(fù)制原則

D.A過程通過高溫破壞DNA分子中的氫鍵，使雙鏈DNA解聚為單鏈

答案A

解析反應(yīng)體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶，該酶的作用是催化合成DNA子

鏈，在C過程中起作用，A錯(cuò)誤；引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列

互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸，用于PCR的引物長度通常為20?30個(gè)核甘酸，且引物

之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，否則引物之間會(huì)配對(duì)形成雙鏈核酸從而失去作用，

B正確；PCR是體外進(jìn)行DNA擴(kuò)增的技術(shù)，根據(jù)題圖可知，PCR擴(kuò)增遵循DNA

半保留復(fù)制原則，C正確；A過程為DNA變性過程，該過程通過高溫破壞DNA

分子中的氫鍵，當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈，D正確。

5.（多選）（2023?遼寧六校聯(lián)考）DNA疫苗是指將編碼保護(hù)性抗原蛋白的基因（如圖甲）

插入適宜的質(zhì)粒（如圖乙）中得到的重組DNA分子，將其導(dǎo)入人體內(nèi)，在人體細(xì)胞

內(nèi)表達(dá)的產(chǎn)物可直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。可選擇的限制酶分別是Bglll.

EcoRI和Sau3AI0下列分析正確的是（）

A.構(gòu)建DNA疫苗時(shí)，可用3g/n和Sau3AI切割目的基因和質(zhì)粒

B.若用EcoRI切割質(zhì)粒，產(chǎn)生的DNA片段具有黏性末端

C.用EcoRI切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接，會(huì)產(chǎn)生多種連接產(chǎn)物

D.圖乙質(zhì)粒用EcoRI切割前后，分別含有2個(gè)和4個(gè)游離的磷酸基團(tuán)

答案ABC

解析分析題圖，外源DNA分子和質(zhì)粒上都含有3種限制酶（3g/n、EcoRI和

SOM3AI）的切割位點(diǎn)，為了防止目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和兩者之間的反向連接,

構(gòu)建DNA疫苗時(shí)，可用Bg/n和SQM3Al切割目的基因和質(zhì)粒，A正確；EcoRI

切割后獲得的是黏性末端，B正確；用EcoRI切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA

連接酶連接，能產(chǎn)生多種連接產(chǎn)物，如目的基因自身環(huán)化、質(zhì)粒自身環(huán)化、目的

基因與質(zhì)粒正向連接、目的基因與質(zhì)粒反向連接等，C正確；圖乙質(zhì)粒用EcoRi

切割前為環(huán)狀DNA分子，不含游離的磷酸基團(tuán)，切割后為鏈狀DNA分子，含有

2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，D錯(cuò)誤。

課時(shí)精練

（時(shí)間：30分鐘）

【基礎(chǔ)對(duì)點(diǎn)】

知識(shí)點(diǎn)1目的基因的篩選與獲取

1.實(shí)驗(yàn)室常用PCR技術(shù)對(duì)DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增，下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）

A.PCR反應(yīng)中目的基因呈指數(shù)形式擴(kuò)增

B.反應(yīng)過程包括變性一復(fù)性一延伸

C.90℃以上時(shí)雙鏈DNA的氫鍵斷開

D.引物與模板結(jié)合后向引物的5,端方向延伸DNA鏈

答案D

解析引物與模板結(jié)合后向引物的3,端方向延伸DNA鏈，D錯(cuò)誤。

2.（2023?北京市十一中學(xué)期中）用PCR擴(kuò)增下面的DNA片段：

5'GACCTGTGGAAGCCATACGGGATTG3'

3'CTGGACACCTTCG.......GTATGCCCTAAC5,

供選擇的引物有：

①5'GACCTGTGGAAGC3'

②5ATACGGGATTG3'

（3）5,GTATGCCCTAAC3,

@5,CAATCCCGTATG3,

共四種，應(yīng)選擇（）

A.①②B.②③

C.③④D.①④

答案D

解析用PCR擴(kuò)增DNA片段的過程中，在引物作用下，耐高溫的DNA聚合酶

從引物3,端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5,端至3,端延伸的，

故引物的堿基序列應(yīng)與每條模板鏈5,端的一段核甘酸鏈的堿基序列相同，即應(yīng)以

模板鏈5,端的一段脫氧核甘酸單鏈片段作為引物；由題干信息分析可知，5,端的

堿基序列是5"GACCTGTGGAAGC和59AATCCCGTATG,故對(duì)應(yīng)的引物為

①5'GACCTGTGGAAGC3'和④5'CAATCCCGTATG3',D正確，A、B、C錯(cuò)誤。

3.下列關(guān)于PCR的敘述，正確的是（）

A.PCR是體外復(fù)制DNA技術(shù)，關(guān)鍵酶是解旋酶和DNA聚合酶

B.DNA聚合酶從引物的5,端開始連接脫氧核昔酸

C.第三輪循環(huán)產(chǎn)物中出現(xiàn)位于兩種引物之間的DNA片段

D.延伸過程需要酶、ATP和4種核糖核甘酸

答案C

解析PCR體外復(fù)制DNA不需要解旋酶，需要耐高溫的DNA聚合酶，A錯(cuò)誤；

DNA聚合酶從引物的3,端開始連接脫氧核甘酸，B錯(cuò)誤；第三輪循環(huán)產(chǎn)物中出現(xiàn)

位于兩種引物之間的DNA片段，C正確；PCR是在較高溫度條件下進(jìn)行的，該

過程需要耐高溫的DNA聚合酶，且PCR反應(yīng)的產(chǎn)物是DNA,因此原料是4種游

離的脫氧核甘酸，不是核糖核甘酸，D錯(cuò)誤。

4.下列有關(guān)獲取目的基因的敘述錯(cuò)誤的是（）

A.目的基因就是編碼蛋白質(zhì)的基因

B.篩選和獲取目的基因是基因工程的第一步

C.來自蘇云金桿菌的Bt基因可作為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因

D.序列比對(duì)工具的應(yīng)用為科學(xué)家找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)

答案A

解析目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，A錯(cuò)誤；目的基因的篩選與獲取是

實(shí)施基因工程的第一步，B正確；來自蘇云金桿菌的及基因可作為培育轉(zhuǎn)基因抗

蟲棉用到的目的基因，C正確；隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫和序列比

對(duì)工具等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，這為科學(xué)家找到合

適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能，D正確。

5.（2021.湖北卷，16）某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基

因條帶（引物與模板完全配對(duì)）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對(duì)）。

為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（）

A.增加模板DNA的量B.延長熱變性的時(shí)間

C.延長延伸的時(shí)間D.提高復(fù)性的溫度

答案D

解析PCR過程中，引物和模板不完全配對(duì)會(huì)形成非特異條帶，增加模板DNA

的量不會(huì)減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，A錯(cuò)誤；延長熱變性的時(shí)間，有利于雙

鏈DNA解聚為單鏈，不能減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，B錯(cuò)誤；延長延伸的

時(shí)間，有利于合成新的DNA鏈，但不能減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，C錯(cuò)誤；

在一定溫度范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，

D正確。

知識(shí)點(diǎn)2基因表達(dá)載體的構(gòu)建

6.（2023?黑龍江齊齊哈爾期中）基因工程的核心是構(gòu)建基因表達(dá)載體，下列不屬于

載體作用的是（）

A.載體能防止目的基因被受體細(xì)胞限制酶“切割”

B.載體能協(xié)助目的基因在受體細(xì)胞中復(fù)制

C.載體含有啟動(dòng)子和終止子協(xié)助目的基因表達(dá)

D.載體具有標(biāo)記基因，便于篩選含目的基因的受體細(xì)胞

答案A

解析載體不能防止目的基因被受體細(xì)胞限制酶“切割”，A錯(cuò)誤；載體在受體細(xì)

胞中能夠穩(wěn)定存在，并且自我復(fù)制，使目的基因數(shù)量擴(kuò)大，B正確；啟動(dòng)子是RNA

聚合酶的識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程，終止子控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束，所以

載體含有的啟動(dòng)子和終止子可協(xié)助目的基因的表達(dá),C正確；載體具有標(biāo)記基因，

標(biāo)記基因便于篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，D正確。

7.（2022.廣西柳州一中月考）下列關(guān)于基因表達(dá)載體的說法，錯(cuò)誤的是（）

A.基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟

B.基因表達(dá)載體包含啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因等

C.終止子位于目的基因的下游，能夠終止翻譯過程

D.不同的目的基因所需的啟動(dòng)子不一定相同

答案C

解析基因表達(dá)載體包括啟動(dòng)子、終止子、目的基因、標(biāo)記基因等，其中啟動(dòng)子

位于目的基因的上游，是啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一段DNA片段，終止子位于目的基因的下

游，能夠終止轉(zhuǎn)錄過程，B正確，C錯(cuò)誤；不同的目的基因具有不同的核甘酸序

列，其啟動(dòng)子也不盡相同，D正確。

8.（2023?黑龍江哈爾濱期末）蜘蛛絲是天然蛋白纖維，其機(jī)械性能高于常用于制作

防彈衣的凱夫拉纖維，有廣泛的應(yīng)用前景。近期，中國科學(xué)家利用質(zhì)粒（如圖）成

功構(gòu)建了蛛絲蛋白基因的重組質(zhì)粒，并在家蠶絲腺細(xì)胞中獲得大量蛛絲蛋白。下

列有關(guān)說法錯(cuò)誤的是（）

XbaISacI

終止子

啟動(dòng)子/X\

力箭頭所指的位

標(biāo)記基因i入〃置是限制酶識(shí)

HindHI別和切割位點(diǎn)

A.為防止目的基因自身環(huán)化，可以用限制酶XOaI和SacI來切割目的基因

B.構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)選用蠶絲蛋白基因的啟動(dòng)子利于基因在家蠶絲腺細(xì)胞中表達(dá)

C.啟動(dòng)子是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合部位，可以驅(qū)動(dòng)遺傳信息的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄

D.基因表達(dá)載體中的標(biāo)記基因可以鑒別與選擇含有蛛絲蛋白基因的受體細(xì)胞

答案C

解析用限制酶Xbal和SacI來切割目的基因，可以使目的基因兩端產(chǎn)生不同

的黏性末端，防止目的基因自身環(huán)化，A正確；為能從蠶絲腺細(xì)胞中提取蛛絲蛋

白，基因表達(dá)載體中目的基因的上游必須含有使其能在蠶絲腺細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)

子，即構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)選用蠶絲蛋白基因的啟動(dòng)子利于基因在家蠶絲腺細(xì)胞中表

達(dá)，B正確；啟動(dòng)子只能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，不能驅(qū)動(dòng)其復(fù)制，C錯(cuò)誤；基因表達(dá)載

體中的標(biāo)記基因的作用是鑒別與選擇含有蛛絲蛋白基因的受體細(xì)胞，D正確。

9.（2023?南師附中期初）載體是基因工程中攜帶外源DNA片段（目的基因）進(jìn)入受體

細(xì)胞的重要運(yùn)載工具，常見的載體類型主要有基因克隆載體和基因表達(dá)載體。下

圖是利用細(xì)菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程示意圖，下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）

A.重組載體A、重組載體B分別是基因克隆載體和基因表達(dá)載體

B.載體A和載體B都必須含有限制酶切割位點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因

C.必須把目的基因插入重組載體A的啟動(dòng)子和終止子之間

D.培養(yǎng)細(xì)菌A和細(xì)菌B的培養(yǎng)基在營養(yǎng)成分和功能上有明顯差異

答案C

解析重組載體A導(dǎo)入受體菌后隨著受體菌的繁殖而擴(kuò)增，因此是基因克隆載體,

而重組載體B導(dǎo)入受體菌后，表達(dá)產(chǎn)生胰島素，因此是基因表達(dá)載體，A正確；

作為運(yùn)載體必須要具備的條件有：含有限制酶的切割位點(diǎn)（便于目的基因的插入）、

復(fù)制原點(diǎn)（便于目的基因的擴(kuò)增）及標(biāo)記基因（便于篩選含有目的基因的受體細(xì)胞）

等，因此載體A和載體B都必須含有限制酶切割位點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因，B

正確；培養(yǎng)細(xì)菌A的目的是擴(kuò)增目的基因，不需要獲得表達(dá)產(chǎn)物，因此目的基因

不一定要插入重組載體A的啟動(dòng)子和終止子之間，C錯(cuò)誤；培養(yǎng)細(xì)菌A的目的是

擴(kuò)增目的基因，培養(yǎng)細(xì)菌B的目的是獲得胰島素，因此培養(yǎng)兩者的培養(yǎng)基在營養(yǎng)

成分和功能上有明顯差異，D正確。

【綜合提升】

10.（2023?河南商丘聯(lián)考）PCR技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合

成技術(shù)。下列有關(guān)PCR技術(shù)的敘述正確的是（）

A.打開DNA雙鏈需依賴解旋酶

B.子鏈延伸的方向是3,端一5,端

C.所用的引物一定是單鏈DNA分子

D.PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行

答案D

解析在PCR技術(shù)中，DNA的解旋是通過控制溫度實(shí)現(xiàn)的，超過90℃,雙鏈

DNA解聚，A錯(cuò)誤；DNA聚合酶從引物的3,端開始延伸DNA鏈，因此，DNA

的合成方向是從子鏈的夕端向3,端延伸，B錯(cuò)誤；引物可以是單鏈DNA分子，

也可以是單鏈RNA分子，C錯(cuò)誤；PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，

PCR反應(yīng)的緩沖溶液的作用是給PCR體系提供一個(gè)最適反應(yīng)條件，D正確。

11.（多選）下列有關(guān)PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的敘述，正確的是（）

A.都屬于半保留復(fù)制

B.都需要DNA聚合酶和DNA連接酶

C.所需的酶在相同溫度下活性不同

D.PCR需要一小段人工合成的DNA或RNA做引物

答案ACD

解析PCR過程中兩條鏈?zhǔn)菃为?dú)、連續(xù)合成的，不像體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)，兩條子

鏈在同一復(fù)制叉中合成，一條鏈不連續(xù)，所以PCR過程不需要DNA連接酶，B

錯(cuò)誤。

12.（2023?北京朝陽區(qū)模擬）PCR弓I物的3,端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵堿基，5,端無

嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶酶切位點(diǎn)等。下列敘述正確的是（）

A.該圖表示PCR循環(huán)中的變性環(huán)節(jié)

B.dNTP作為擴(kuò)增的原料會(huì)依次連接到5,端

C.耐高溫的DNA聚合酶催化相鄰的兩個(gè)dNTP之間形成磷酸二酯鍵

D.用圖中引物擴(kuò)增兩個(gè)循環(huán)后即可獲得兩端添加限制酶酶切位點(diǎn)的產(chǎn)物

答案C

解析圖中引物與模板鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)，該圖表示PCR循環(huán)中的復(fù)性環(huán)節(jié)，A錯(cuò)

誤；DNA聚合酶只能催化脫氧核甘酸連接在3,端，所以dNTP作為擴(kuò)增的原料會(huì)

依次連接到3,端，B錯(cuò)誤；延伸時(shí)，在耐高溫的DNA聚合酶催化下，相鄰的dNTP

間形成磷酸二酯鍵，C正確；由于兩個(gè)引物均不在該片段的端點(diǎn)，因此第一輪循

環(huán)后得到的兩個(gè)DNA片段中兩條脫氧核甘酸鏈都不等長，第二輪中亦不會(huì)出現(xiàn)

兩條鏈等長的目的DNA片段，在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中