武漢大學病理教研室免疫組織化學應用IHC經(jīng)過檢測細胞內(nèi)、細胞表面或細胞間正?；虍惓Ｎ镔|(zhì)，以研究組織細胞正常生理、代謝及疾病病因、發(fā)病機理，廣泛用于各種蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)表示水平檢測，細胞屬性判定、淋巴細胞免疫表型分析、細胞增殖和凋亡研究，以及細胞周期和信號轉(zhuǎn)導研究等。免疫組織化學染色SP技術第1頁武漢大學病理教研室試驗名稱鏈霉菌親和素-過氧化物酶連結法(Streptavidin-PeroxidaseConjugatedMethod,簡稱S-P法)檢測胃癌組織CK／Vimentin蛋白表示免疫組織化學染色SP技術第2頁武漢大學病理教研室S-P法原理示意圖過氧化物酶鏈酶親和素生物素生物素化二抗特異性一抗待測抗原免疫組織化學染色SP技術第3頁武漢大學病理教研室免疫組織化學基本試驗流程組織、細胞標本

抗原修復

阻斷內(nèi)源性過氧化物酶

正常血清封閉

滴加特異性一抗滴加二抗

滴加三抗顯色復染封片

免疫組織化學染色SP技術第4頁武漢大學病理教研室詳細步驟以下：1．石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，以0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；2．全部組織均采取微波修復抗原；3．室溫冷卻后，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；4．滴加50μl過氧化物酶阻斷液（試劑A），37℃濕盒孵育10min；5．0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；6．滴加非免疫性動物血清（試劑B），37℃濕盒孵育10min；免疫組織化學染色SP技術第5頁武漢大學病理教研室7．甩去多出血清，分別滴加２種抗體，4℃濕盒孵育過夜，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；8．滴加生物素標識二抗（試劑C），37℃濕盒孵育15min，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；9．滴加鏈親和素-過氧化物酶溶液（試劑D），37℃濕盒孵育15min，甩去多出液體；10．每片滴加新鮮配制二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，光鏡下控制反應時間（約為1-5min），自來水充分沖洗，蘇木素復染；11．常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片并鏡檢分析；12．陽性對照采取已知陽性片為標準，陰性對照采取PBS取代第一抗體，其余步驟相同。免疫組織化學染色SP技術第6頁武漢大學病理教研室試驗流程中注意事項內(nèi)源性過氧化物酶滅活血清封閉沖洗抗體選擇及一抗孵育時間檢測及顯色系統(tǒng)復染免疫組織化學染色SP技術第7頁武漢大學病理教研室染色前處理

－取材、脫水、浸蠟組織及時固定

固定劑選擇：10%中性緩沖福爾馬林4%多聚甲醛常規(guī)下固定8-二十四小時取材厚度：2mm免疫組織化學染色SP技術第8頁武漢大學病理教研室染色前處理

－預防脫片常選取多聚耐氨酸（poly-L-lysine）注意：1）應嚴格控制使用次數(shù)2）玻片潔凈度免疫組織化學染色SP技術第9頁武漢大學病理教研室染色前處理

－包埋與切片

包埋：選擇低熔點石蠟，溫度不超出62℃切片：厚度

3-4μm

烤片：溫度60℃，時間1小時；或60℃2小時（邁新）；或60℃過夜免疫組織化學染色SP技術第10頁武漢大學病理教研室染色前處理

－切片保留切片不宜長時間在常溫下保留免疫組織化學染色SP技術第11頁武漢大學病理教研室染色前處理

－脫臘標準：免疫組化脫蠟試劑應與常規(guī)HE脫蠟分開免疫組織化學染色SP技術第12頁武漢大學病理教研室試驗操作中應用抗原修復試驗操作中注意事項免疫組織化學染色SP技術第13頁武漢大學病理教研室抗原修復影響染色結果最關鍵原因抗原修復方法分類1）酶消化法2）加熱法（高壓法?水煮法?微波法）抗原修復液選擇

1）檸檬酸鹽緩沖液（PH7.2-7.4）2）Tris（PH7-8）3）EDTA（PH8.0）

免疫組織化學染色SP技術第14頁武漢大學病理教研室內(nèi)源性過氧化物酶滅活存在部位：紅細胞、橫紋肌細胞、粒細胞、單核細胞、肝細胞及腎細胞消除方法：3%H2O2浸泡10分鐘免疫組織化學染色SP技術第15頁武漢大學病理教研室血清封閉目標：降低非特異性著色時間：普通在加載一抗之前使用免疫組織化學染色SP技術第16頁武漢大學病理教研室沖洗普通采取PBS（PH7.4-7.6）充分沖洗增加效果可加入Tween20免疫組織化學染色SP技術第17頁武漢大學病理教研室一抗孵育時間及抗體選擇應選擇信譽高、質(zhì)量好試劑企業(yè)抗體切忌重復凍融一抗為濃縮液時，需選擇最正確稀釋濃度按說明書可采取37℃1-2小時或4℃冰箱過夜免疫組織化學染色SP技術第18頁武漢大學病理教研室檢測及顯色系統(tǒng)普通采取以生物素標識辣根過氧化物酶為基礎檢測方法。如SP、LSABC、ABC等顯色方法：經(jīng)常采取辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測免疫組織化學染色SP技術第19頁武漢大學病理教研室顯色系統(tǒng)慣用酶1.辣根過氧化物酶(HRP)A:顯色底物DAB-----棕黃色敏感度高、定位清楚、易于觀察、保留B:顯色底物AEC-----磚紅色2.堿性磷酸酶(AP)顯色底物:BCIP/NBT----藍紫色免疫組織化學染色SP技術第20頁武漢大學病理教研室復染標準：注意二者之間對比，突出陽性信號免疫組織化學染色SP技術第21頁武漢大學病理教研室試驗對照設計標準：全部檢測指標均設陽性對照、陰性對照編號陽性片待檢片陰性對照結論1－－－操作失誤，抗體失效2＋＋＋非特異性著色3－＋－陽性片不含靶抗原4＋－－待檢片不含定位抗原5＋＋