關(guān)于血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握電泳法分離蛋白質(zhì)的原理2、學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的原理和操作方法3、學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)染色的方法第2頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天分離蛋白質(zhì)的方法分離方法沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法層析法電泳法薄膜電泳等電聚焦電泳聚丙烯酰胺電泳離子交換層析吸附層析凝膠過(guò)濾（分子篩）親和層析第3頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)原理

電泳：是指帶電粒子在電場(chǎng)中向本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。在一定pH條件下，不同的蛋白質(zhì)由于具有不同的等電點(diǎn)而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可對(duì)它們進(jìn)行分離。第4頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天以蛋白質(zhì)為例：H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI第5頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天影響電泳遷移率的因素：

1、內(nèi)在因素：蛋白所帶凈電荷的性質(zhì)和電荷的量、蛋白的大小和形狀

2、外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的pH值、溶液的離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象第6頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天血清中幾種主要蛋白組分：血清蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分子量占總蛋白的％清蛋白4.64

69,00057～72α1－球蛋白5.00

200,0002～5α2－球蛋白5.06300,000

4～9β－球蛋白5.1290,000～150,000

6.5～12γ－球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20

緩沖液pH=8.6

pI＜pH血清蛋白帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)第7頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜作為支持介質(zhì)醋酸纖維薄膜：將纖維素的羥基乙?；癁榇姿狨?，溶于丙酮后制成有均一細(xì)密微孔的薄膜，其厚度為0.1～0.15mm

第8頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天染色劑一般蛋白質(zhì)染色常使用氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、麗春紅糖蛋白用甲苯胺藍(lán)或過(guò)碘酸-Schiff試劑脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色

第9頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)操作1.醋酸纖維素薄膜的潤(rùn)濕與選擇

將醋酸纖維素薄膜浸于緩沖液中約30min后，取醋酸纖維素薄膜放在濾紙中并吸干表面液體。整條薄膜顏色一致而無(wú)白色斑點(diǎn)，則表明薄膜質(zhì)地均勻(實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選擇質(zhì)地均勻的膜)。2.電泳槽的準(zhǔn)備

電泳槽有兩個(gè)互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負(fù)極。每個(gè)槽上都有一根可移動(dòng)的橫桿，濾紙的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成濾紙橋。第10頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.點(diǎn)樣：

點(diǎn)樣前，將薄膜粗糙面朝上，距一邊1.5cm處用鉛筆劃一條平行線作為點(diǎn)樣標(biāo)志區(qū)。點(diǎn)樣時(shí)，用點(diǎn)樣器毛吸取血清，在薄膜粗糙面上輕而溫和地印一下（蓋章法）。點(diǎn)樣區(qū)距陰極端1.5cm（見(jiàn)圖）。此步是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。

醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖（黑線處為點(diǎn)樣位置）

點(diǎn)樣區(qū)6.5cm1.5cm第11頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.電泳

將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽(yáng)極端支架上。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。連接好電泳儀。在室溫下電泳，恒壓110V，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，電泳時(shí)間60min。電泳后，調(diào)節(jié)旋鈕使電壓為零，關(guān)閉電泳儀切斷電源。第12頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.染色：電泳完畢后將薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡5min，染色時(shí)可置于搖床，均勻搖晃。6.漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗3次，每次5min,直至背景藍(lán)色脫盡，條帶清晰為止，取出薄膜放在濾紙上，用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干或者自然晾干。第13頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天8.記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

透明后可將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對(duì)位置進(jìn)行描述、記錄，并判斷分析結(jié)果。透明后的薄膜可作掃描或照相。正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖

1．為清蛋白，2，3，4，5，分別為α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6為點(diǎn)樣原點(diǎn)

第14頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)1、薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。2、點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，薄膜吸水量以不干不濕為宜。3、點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞薄膜或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的粗糙面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過(guò)多或過(guò)少。5、電泳時(shí)應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且點(diǎn)樣面向下。6、應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長(zhǎng)，薄膜底色不易脫去；時(shí)間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。第15頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25