高效液相色譜法一、色譜法概述色譜法是一種分離技術(shù)色譜法原理

是利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解、分配、吸附等化學(xué)作用性能的差異，當兩相作相對運動時，使各組份在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達到相互分離。兩相中有一相是固定的，叫作固定相，有一相是流動的，成為流動相。高效液相色譜是以液體為流動相的色譜方法。按照固定相不同分為：液液分配色譜；液固吸附色譜；離子交換色譜；尺寸排阻色譜(凝膠滲透色譜)。

此外，還有親和色譜、平板色譜(薄層色譜)等。HPLC與GC的比較分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只占有機物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機物總數(shù)的80%。流動相的選擇：GC采用的流動相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用小；HPLC采用的流動相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機會多。它除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭，即流動相對分離的貢獻很大，可通過溶劑來控制和改進分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進行。高效液相色譜與氣相色譜比較氣相色譜高效液相色譜只能分析揮發(fā)性物質(zhì)，只能分析20%的化合物幾乎可以分析各種物質(zhì)不能分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)可以分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)用毛細管色譜可得到很高的柱效色譜柱不能很長，柱效不會很高有很靈敏的檢測器如ECD和較靈敏的通用檢測器(FID和TCD)沒有較高靈敏的通用檢測器流動相為氣體，無毒，易于處理流動相有毒，費用較高運行和操作容易運行和操作比GC難一些儀器制造難度較小儀器制造難度大液相色譜儀結(jié)構(gòu)流程HPLC儀器結(jié)構(gòu)圖注射器進樣器高壓泵混合室溶劑預(yù)柱接頭色譜柱檢測器數(shù)據(jù)系統(tǒng)高效液相色譜分析過程

分析前，選擇適當?shù)纳V柱和流動相。開泵，沖洗柱子，待柱子達到平衡而且基線平直后，用微量注射器把樣品注入進樣口，流動相把試樣帶入色譜柱進行分離，分離后的組分依次流入檢測器的流通池，最后和洗脫液一起排入流出物收集器。當有樣品組分流過流通池時，檢測器把組分濃度轉(zhuǎn)變成電信號，經(jīng)過放大輸入計算機，經(jīng)過工作站數(shù)據(jù)處理，就得到色譜圖。色譜圖是定性、定量和評價柱效高低的依據(jù)。二、主要部件(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150×105～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相(<10μm)，液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)，脈沖小，流量穩(wěn)定可調(diào)，耐腐蝕等特性。(2)進樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，

結(jié)構(gòu)如圖所示：(3)高效分離柱柱體為直形不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。(4)檢測器

a.紫外-可見光檢測器⑴檢測原理：基于Lambert-Beer定律，即被測組分對紫外光或可見光具有吸收，且吸收強度與組分濃度成正比。液相色譜儀一般都配置有UV-Vis檢測器⑵組成：光源、流通池、檢測元件、工作站等。⑶特點：①靈敏度高，噪聲低；②不破壞樣品，可用于制備；③對溫度、流動相流速波動不敏感，可用于梯度淋洗；④屬于濃度型檢測器。⑷缺點①只能檢測有紫外吸收的樣品；②檢測波長＞流動相的截止波長。⑸波長選擇①選擇λmax作檢測波長，以得到較高的靈敏度；②檢測波長＞流動相的截止波長。⑹紫外檢測器的類型①固定波長型(已淘汰)；②可變波長型(最常用)；③二極管陣列檢測器(最新型)。b.光電二極管陣列檢測器

紫外檢測器的重要進展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖。二極管陣列檢測器(diode-arraydetector,DAD)以光電二極管陣列作為檢測元件的紫外檢測器它可構(gòu)成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長的信號，然后，對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時間、光強度和波長的三維譜圖。DAD與UV檢測器的區(qū)別普通UV檢測器是先用單色器分光，然后讓特定波長的光進入流通池。DAD檢測器是先讓所有波長的光都通過流通池，然后通過一系列分光技術(shù)，使所有波長的光在接受器上被檢測。c.示差折光檢測器

（Differentialrefractiveindexdetector）

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器?？蛇B續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度成正比。

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）。靈敏度低，對溫度敏感，不能用于梯度洗脫。

d.熒光檢測器

（Fluorescencedetector）許多有機物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強的活性。熒光檢測器是一種選擇性很強的檢測器，其靈敏度比UV檢測器高2~3個數(shù)量級。對多環(huán)芳烴，維生素B，黃曲霉素，卟啉類化合物，農(nóng)藥，藥物，氨基酸，甾類化合物等有響應(yīng)。5）電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器主要用于離子色譜的檢測。其原理是基于待測物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來測量電離物質(zhì)的含量。電導(dǎo)檢測器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。另外，當pH>7時，該檢測器不夠靈敏。

HPLC流動相和固定相簡介一、流動相與GC流動相不同，HPLC流動相為溶劑，它既有運載作用，又和固定相一樣，參予對組分的競爭，因此溶劑的選擇對分離十分重要。理想的溶劑應(yīng)有下列特性：1）對待測物具一定極性和選擇性；2）使用UV檢測器時，溶劑截止波長要小于測量波長；使用折光率檢測器，溶劑的折光率要與待測物的折光率有較大差別；3）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時使截止波長增加；4）化學(xué)穩(wěn)定性好；5）適宜的粘度。粘度過高，柱壓增加；過低，易產(chǎn)生氣泡。溶劑的脫氣處理脫氣目的：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡對測定的影響：1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動脫氣方法1.超聲波脫氣法2.抽濾脫氣法3.He脫氣法1.正相洗脫用極性小于固定相的流動相的洗脫方式，稱為正相洗脫、正相展開。適用于正相色譜法。例如，水、正己烷、正戊烷的值分別為10.2、0.1、0.0，作正相洗脫時，水洗脫能力最強，正己烷和正戊烷的洗脫能力最弱。流動相(溶劑系統(tǒng))>>

正相洗脫與反相洗脫1.等度洗脫(isocraticelution)用恒定配比的溶劑系統(tǒng)的洗脫方式，稱為等度洗脫優(yōu)點：簡便、重復(fù)性好、色譜柱易再生。缺點：對于成分復(fù)雜的樣品，效果欠佳。2.梯度洗脫(gradientelution)梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值、離子強度相應(yīng)地變化，達到提高分離效果、縮短分析時間的目的。流動相(溶劑系統(tǒng))>>

洗脫方式

流動相(溶劑系統(tǒng))>>

洗脫方式梯度洗脫的實質(zhì)：是通過不斷地變化流動相的濃度配比，來調(diào)整混合樣品中各組分的K值，使所有譜帶都以最佳平均K值通過色譜柱。比較梯度洗脫與程序升溫：在梯度洗脫中溶質(zhì)K值的變化是通過溶劑的極性、pH值和離子強度來實現(xiàn)的，用于分離組分性質(zhì)差別較大的復(fù)雜樣品；而程序升溫是借改變溫度來影響溶質(zhì)的K值，用于分離寬沸程的混合樣品。優(yōu)點：①縮短分析周期；②提高分離效果；③改善峰形，很少拖尾；④增加檢測靈敏度。等度洗脫與梯度洗脫1.按承受壓力分剛性固體：SiO2為基質(zhì)，耐壓為7.0×108~1.0×109Pa?？芍瞥芍睆?、形狀和孔隙深度不同的顆粒；主要用于吸附、分配和鍵合色譜；硬膠：以聚合物為基質(zhì)(常用苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成)，耐壓上限為

3.5×108Pa,主要用于離子交換和尺寸排阻色譜。二、固定相載體由于各種HPLC分離方法的流動相均為液體，因此，HPLC通常是按照固定相載體或固定液的不同來分類的。2.按孔隙深度分表面多孔型：以實心玻璃珠為基體，在基體表面覆蓋一層多孔活性材料(如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的顆粒大(易裝柱)、多孔層厚度小且孔淺(滲透性好，出峰快)；但交換容量小。適于常規(guī)分離分析。全多孔型：全部由硅膠或氧化鋁微粒聚集而成，因顆粒極細，因而孔徑小、傳質(zhì)快、柱效高。特別適于復(fù)雜混合物的分離。2、色譜基本參數(shù)與流出曲線的表征1.基線

無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線。2.保留值

（1）時間表示的保留值保留時間(tR)：組分從進樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時所需的時間；（動畫）

死時間(tM)：不與固定相作用的氣體(如空氣)的保留時間；調(diào)整保留時間（tR

＇）：tR＇=

tR－tM

（2）用體積表示的保留值

保留體積（VR）：

VR=tR×qvqv為柱出口處的載氣流量，單位：mL/min。

死體積（VM）：

VM=

tM×qv

調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR

－VM

3.相對保留值r21

組分2與組分1調(diào)整保留值之比：

r21=t′R2

/t′R1=V′R2/V′R1

相對保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對這兩種組分的選擇性。4.區(qū)域?qū)挾?/p>

衡量色譜峰寬度的參數(shù)，三種表示方法：（1）標準偏差(

)：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2)：色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354

。（3）峰底寬(Wb)：Wb=4

。2.相平衡參數(shù)

（1）分配系數(shù)（partitioncoefficient）

K

組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：g/mL）比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。分配系數(shù)K的討論

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。3.分配比（partitionradio）k一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的質(zhì)量比。

1.分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。

2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時間越長。

3.分配比可以由實驗測得。

分配比也稱：容量因子(capacityfactor)和容量比(capacityradio)；4.容量因子與分配系數(shù)的關(guān)系

式中β為相比。填充柱相比：6～35；毛細管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保留時間越長。

VM為流動相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；

VS為固定相體積，對不同類型色譜柱，VS的含義不同；

氣-液色譜柱：VS為固定液體積；

氣-固色譜柱：VS為吸附劑表面容量。5.分配比與保留時間的關(guān)系

滯留因子（retardationfactor）：us：組分在分離柱內(nèi)的線速率；u：流動相在分離柱內(nèi)的線速度；滯留因子RS也可以用質(zhì)量分數(shù)w表示：

若組分和流動相通過長度為L的分離柱，需要的時間分別為tR和tM，則tR=tM(1+k)通過上式可直接由實驗獲得的保留值求出分配比。6.分離因子

分離因子（也稱為選擇性因子）也可用來衡量兩物質(zhì)的分離程度，用α表示。

7.色譜流出曲線的數(shù)學(xué)描述

色譜峰為正態(tài)分布時，色譜流出曲線上的濃度與時間的關(guān)系為

當色譜峰為非正態(tài)分布時，可按正態(tài)分布函數(shù)加指數(shù)衰減函數(shù)構(gòu)建關(guān)系式。色譜理論需要解決的問題？色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學(xué)和動力學(xué)問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標及其關(guān)系。組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜過程的動力學(xué)因素控制；（兩相中的運動阻力，擴散）兩種色譜理論：塔板理論和速率理論。

塔板理論的假設(shè)：

(1)每一個平衡過程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達到；

(2)將載氣看作成脈動（間歇）過程；

(3)試樣沿色譜柱方向的擴散可忽略；

(4)每次分配的分配系數(shù)相同。3.2.2

塔板理論-柱分離效能指標

1.塔板理論（platetheory）

半經(jīng)驗理論；將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)。

色譜柱長：L，虛擬的塔板間距離：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為保留時間包含死時間，在死時間內(nèi)不參與分配!理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為

n=L/H色譜峰的方差

與柱長或保留時間的關(guān)系為：

2.有效塔板數(shù)和有效塔板高度

單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質(zhì)計算可得到不同的理論塔板數(shù)。組分在tM時間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：3.塔板理論的特點和不足

(1)當L一定時，n

越大(H越小)，被測組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。

(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的K不同，用n有效和H有效作為衡量柱效能的指標時，應(yīng)指明測定物質(zhì)。

(3)柱效的高低不能表示被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分配系數(shù)K相同時，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。

(4)塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實驗結(jié)果，也無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。3.2.3

速率理論-影響柱效的因素1.速率方程（也稱范·弟姆特方程式）

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，

u：載氣的線速率(cm/s)。

減小A、B、C三項可提高柱效。存在著最佳流速。

A，B，C三項各與哪些因素有關(guān)？A─渦流擴散項

A=2λdpdp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子

固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。B/u—分子擴散項

B=2υDg

υ：彎曲因子，填充柱色譜，υ<1。

Dg：試樣組分分子在氣相中的擴散系數(shù)（cm2·s-1）

(1)存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴散;(2)擴散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差;(3)B/u與流速有關(guān)，流速↓，滯留時間↑，擴散↑;(4)擴散系數(shù)：Dg

∝(M載氣)-1/2，M載氣↑，B值↓。

k為容量因子；Dg

、DL為擴散系數(shù)。減小擔(dān)體粒度，選擇相對分子質(zhì)量小的氣體作載氣，可降低傳質(zhì)阻力。C·u—傳質(zhì)阻力項傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL，即

C=（Cg+CL）（動畫）2.載氣流速與柱效——最佳流速載氣流速高時：

傳質(zhì)阻力項是影響柱效的主要因素，流速

，柱效

。載氣流速低時：

分子擴散項成為影響柱效的主要因素，流速

,柱效

。H-u曲線與最佳流速：

由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。3.速率理論的要點

(1)組分分子在柱內(nèi)運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散、傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達到等是造成色譜峰擴展柱效下降的主要原因。

(2)通過選擇適當?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。

(3)為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。

(4)各種因素相互制約：載氣流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提