第二章第五節(jié)種子擴大培養(yǎng)種子必須具備的條件幾個概念

微生物的擴大培養(yǎng)

種子擴大培養(yǎng)的任務：不但要得到純而壯的培養(yǎng)物，而且要獲得活力旺盛的、接種數量足夠的培養(yǎng)物。對于不同產品的發(fā)酵過程來說，必須根據菌種生長繁殖速度快慢及生產的規(guī)模決定種子擴大培養(yǎng)的級數。一、種子擴大培養(yǎng)流程圖

實驗室種子制備階段〔一級種子培養(yǎng)〕生產車間種子制備階段〔二級種子培養(yǎng)、三級種子培養(yǎng)〕二級發(fā)酵三級發(fā)酵砂土孢子冷凍枯燥孢子斜面孢子搖瓶液體培養(yǎng)茄子瓶斜面培養(yǎng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)〔一〕實驗室種子的制備

兩種方式：在固體培養(yǎng)基上生產大量孢子的孢子制備過程

在液體培養(yǎng)基中生產大量菌絲的種子制備過程。1．孢子制備

孢子制備是種子制備的開始，是發(fā)酵生產的一個重要環(huán)節(jié)。孢子的質量、數量對以后菌絲的生長、繁殖和發(fā)酵產量都有明顯的影響，不同菌種的孢子制備工藝有其不同的特點。(1)放線菌孢子的制備瓊脂斜面培養(yǎng)基：適合產孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等；碳源和氮源不要太豐富(碳源約為1％，氮源不超過0.5％)。碳源豐富：生理酸性環(huán)境，不利于放線菌孢子的形成；氮源豐富：有利于菌絲繁殖而不利于孢子形成。一般情況下，枯燥和限制營養(yǎng)可直接或間接誘導孢子形成。放線菌斜面的培養(yǎng)溫度大多數為28℃，少數為37℃，培養(yǎng)時間為5～14天。(2)霉菌孢子的制備培養(yǎng)基：天然農產品如大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等；營養(yǎng)成分較適合霉菌的孢子繁殖；培養(yǎng)基外表積較大，可獲得大量的孢子。霉菌的培養(yǎng)一般為25~28℃，培養(yǎng)時間為4～14天。(3)細菌培養(yǎng)物的制備細菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有機氮源。培養(yǎng)溫度：多數為37℃，少數為28℃。培養(yǎng)時間：1—2天，產芽孢的細菌那么需培養(yǎng)5一10天。

實驗室種子的制備：

e.g產黃青霉菌(P.chrysogonum)原始菌種斜面試管獲得孢子250ml茄子瓶〔大米或小米〕25~28℃，4~14天成熟〔在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4℃冰箱保存〕。(4)斜面種子的制備斜面種子：在試管或扁瓶內，瓊脂固化的培養(yǎng)基外表上生長的菌種培養(yǎng)物。制備流程：略制備過程本卷須知：A

瓊脂要完全浸沒在營養(yǎng)液內，用量1.0%-2.5%B營養(yǎng)液中最好不含易沉淀的固形物；C裝量掌握在斜面頂端不超過試管或扁平長度的2/3；D滅菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以減少冷凝水；F微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量參加。影響斜面種子質量的因素(1)原材料質量，水質，培養(yǎng)基pH(2)滅菌條件(3)接種量(4)培養(yǎng)室溫度、濕度、通風(5)培養(yǎng)時間(6)有害氣體或揮發(fā)物〔培養(yǎng)室內不要安紫外燈〕(7)冷藏條件2.液體種子制備

種子制備將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的孢子或菌體轉入到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。種子制備所使用的培養(yǎng)基和其他工藝條件，都要有利于孢子發(fā)芽和菌絲繁殖?！捕成a車間種子制備

1.搖瓶種子制備三、種子培養(yǎng)

工業(yè)微生物培養(yǎng)的類型靜置培養(yǎng)法：即將培養(yǎng)基盛于發(fā)酵容器中，在接種后，不通空氣進行培養(yǎng)發(fā)酵，也稱為嫌氣性培養(yǎng)

(anaerobicculturing)通氣培養(yǎng)法：生產菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長的環(huán)境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長和發(fā)酵，也稱為好氣性培養(yǎng)(aerobicculturing)。種子擴大培養(yǎng)的方法：1外表培養(yǎng)法〔surfaceculturing)：

好氧靜置培養(yǎng)法。針對容器內培養(yǎng)基物形態(tài)又分為液態(tài)外表培養(yǎng)和固體外表培養(yǎng)。相對于容器內培養(yǎng)基體積而言，外表積越大，越易促進氧氣由氣液界面向培養(yǎng)基內傳遞。這種方法菌的生長速度與培養(yǎng)基的深度有關，單位體積的外表積越大，生長速度越快。4.載體培養(yǎng)法以天然或人工合成的多孔材料代替麩皮之類的固態(tài)基質作為微生物的載體，營養(yǎng)成分可嚴格控制，可反復使用。要求：耐蒸汽加熱或藥物滅菌四、種子質量控制〔一〕影響孢子質量的因素及控制1、培養(yǎng)基2、培養(yǎng)溫度和濕度3、培養(yǎng)時間和冷藏時間4、接種量1.培養(yǎng)基培養(yǎng)基原材料質量：如四環(huán)素、土霉素生產中配制孢子培養(yǎng)基的麩皮〔wheatbran〕、霉菌用的大〔小〕米、瓊脂的牌號的不同、蛋白胨加工原料不同等均影響種子的質量。原料質量的波動，起主要作用的是其中的無機鹽含量的不同，如微量元素Mg2+、Ca2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質量。水質的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質波動，影響種子質量。菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現的菌落類型也越多，不利于生產的穩(wěn)定。解決措施

斜面培養(yǎng)基所用的主要原材料，糖、氮、磷含量需經過化學分析及搖瓶發(fā)酵試驗合格后才能使用；嚴格控制滅菌后的培養(yǎng)基質量；斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當溫度下放置一定的時間，使斜面無冷凝水呈現，水分適中有利于孢子生長。配制孢子培養(yǎng)基還應該考慮不同代謝類型的菌落對多種氨基酸的選擇。在制備固體培養(yǎng)基時有兩條經驗：①供生產用的孢子培養(yǎng)基或作為制備砂土孢子或傳代所用的培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，以便保持正常菌落類型的優(yōu)勢；②作為選種或別離用的平板培養(yǎng)基，那么需采用較復雜的有機氮源，目的是便于選擇特殊代謝的菌落。2.培養(yǎng)溫度和濕度要獲得高質量的孢子，其最適溫度區(qū)間很狹窄。制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數量影響很大。如土霉素生產菌種龜裂霉菌的孢子，在北方枯燥地區(qū)孢子斜面長的快，在含少量水分的試管斜面培養(yǎng)基中下部孢子長的好，而上部孢子稀少；氣溫高，濕度大的地區(qū)，斜面孢子長的慢，試管下部冷凝水多而不利于孢子形成?？諝庵邢鄬穸雀邥r，培養(yǎng)基內的水分蒸發(fā)少，相對濕度低時，培養(yǎng)基內的水分蒸發(fā)多。在一定條件下培養(yǎng)斜面孢子時，在北方相對濕度控制在40％～45％，在南方相對濕度控制在35％一42％，所得孢子質量較好。

一般來說，真菌對濕度要求偏高，而放線菌對濕度要求偏低。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)時，如果相對濕度偏低，可放入盛水的平皿，提高墻養(yǎng)箱內的相對濕度。為了保證新鮮空氣的交換，培養(yǎng)箱每天宜開啟幾次，以利于孢子生長，現代化的培養(yǎng)箱恒溫、恒濕，并可換氣，不用人工控制．最適培養(yǎng)溫度和濕度是相對的，例如相對濕度、培養(yǎng)基組分不同，對微生物的最適溫度會有影響。培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組分不同也會影響到微生物培養(yǎng)的最適相對濕度。

3.培養(yǎng)時間和冷藏時間孢子的培養(yǎng)工藝一般選擇在孢子成熟階段時終止培養(yǎng)，此時顯微鏡下可見到成串孢子或游離的分散孢子。孢子過于年輕經不起冷藏；過于衰老會導致生產能力下降；孢子培養(yǎng)時間應控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產量正常的階段終止培養(yǎng)。冷藏時間：宜短不宜長。如土霉素菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右，即于4℃冰箱保存，發(fā)現冷藏7-8天菌體自溶，而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現自溶。鏈霉素生產菌，斜面孢子在6℃冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低8%。4.接種量〔二〕影響種子質量的因素1.培養(yǎng)基原材料質量：種子培養(yǎng)基原材料質量的控制類似于孢子培養(yǎng)基原材料質量的控制。原料質量的波動，起主要作用的是其中的無機鹽含量的不同。P含量的多少也影響種子的質量。氨基酸發(fā)酵中，淀粉水解糖制備后，參加其他的營養(yǎng)物〔麩皮水解液、豆餅水解液、玉米漿〕，也對種子質量多少有些影響。

2.培養(yǎng)條件：

六種子質量標準

不同產品、不同菌種以及不同工藝條件的種子質量有所不同。判斷種子質量的優(yōu)劣需要有豐富的實踐經驗。發(fā)酵工業(yè)生產上常用的種子質量標準：(1)細胞或菌體種子培養(yǎng)的目的：獲得健壯和足夠數量的菌體。種子質量的重要指標：菌體形態(tài)、菌體濃度以及培養(yǎng)液的外觀。菌體形態(tài)可通過顯微鏡觀察來確定，以單細胞菌體為種子的質量要求是菌體健壯、菌形一致均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)。以霉菌、放線菌為種子的質量要求是菌絲粗壯，對某些染料著色力強、生產旺盛、菌絲分枝情況和內含物情況良好。菌體的生長量也是種子質量的重要指標，生產上常用離心沉淀法、光密度法和細胞計數法等進行測定。種子液外觀如顏色、黏度等也可作為種子質量的粗略指標。(2)生化指標種子液的糖、氮、磷含量的變化和pH值變化是菌體生長繁殖、物質代謝的反映，不少產品的種子液質量是以這些物質的利用情況且變化為指標的。(3)產物生成量種子液中產物的生成量是多種發(fā)酵產品發(fā)酵中考察種子質量的重要指標，因為種子液中產物生成量的多少是種子生產能力和成熟程度的反映。(4)酶活力測定種子液中某種酶的活力，作為種子質量的標準，是一種較新的方法。如：土霉素生產的種子液中的淀粉酶活力與土霉素發(fā)酵單位有一定的關系，因此種子液淀粉酶活力可作為判斷該種子質量的依據。此外，種子應確保無任何雜菌污染。6．種子異常的分析(2)菌絲結團(3)菌絲粘壁思考題P49常用的