一株抗參銹腐病菌的丹參菌株f05發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

西洋參銹腐病是對(duì)西洋參栽培過(guò)程中造成的嚴(yán)重疾病，主要是由破壞柱菌cylimatendetrocan引起的土壤傳播病。一般年發(fā)病率在30%左右,嚴(yán)重地塊高達(dá)70%以上?；疾⒏兩癄€,幾乎失去藥用價(jià)值和商品價(jià)值。對(duì)西洋參病害的防治,國(guó)內(nèi)外多采用化學(xué)防治,1年需施藥10余次。大量化學(xué)農(nóng)藥的施用,不但污染環(huán)境,而且?guī)?lái)農(nóng)藥殘留問(wèn)題,降低了品質(zhì)以及經(jīng)濟(jì)效益。本實(shí)驗(yàn)篩選了病原菌的拮抗放線菌并對(duì)其進(jìn)行了培養(yǎng)基的優(yōu)化,同時(shí)探討了生產(chǎn)上常用的農(nóng)藥與放線菌復(fù)配的可行性,以期實(shí)現(xiàn)對(duì)西洋參銹腐病進(jìn)行綜合防治。1材料和方法1.1糖培養(yǎng)基的制備分離與篩選培養(yǎng)基:高氏1號(hào)培養(yǎng)基;發(fā)酵種子培養(yǎng)基:液體馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基;原始發(fā)酵培養(yǎng)基:麥麩3%,豆餅粉1.5%;發(fā)酵培養(yǎng)基:本實(shí)驗(yàn)篩選的碳源為麥麩、玉米粉、玉米秸稈粉,氮源為豆餅粉、脲、磷酸氫二銨,無(wú)機(jī)鹽為硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、氯化鈉。1.2材料的分離選好采集地點(diǎn)后,鏟去表層土,四分法取樣,裝入無(wú)菌牛皮紙袋中,帶回實(shí)驗(yàn)室盡快分離。放線菌的分離參照文獻(xiàn)方法,其篩選參照文獻(xiàn)采用稀釋平板法對(duì)土樣進(jìn)行分離,并篩選出對(duì)西洋參銹腐病菌的抑制率最大的菌株。抑制率=對(duì)照菌落半徑?處理菌落半徑對(duì)照菌落半徑?原菌餅半徑=對(duì)照菌落半徑-處理菌落半徑對(duì)照菌落半徑-原菌餅半徑1.3菌種的活化將篩選出的菌株培養(yǎng)于試管中,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。用前?2℃培養(yǎng)箱活化48h,將活化好的菌種擴(kuò)繁于90mm的培養(yǎng)皿中。接種時(shí),將平板菌種接種于盛有200mL無(wú)菌培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,每培養(yǎng)皿接種3瓶,于32℃,140r·min-1振蕩培養(yǎng)48h。1.4培養(yǎng)基的培養(yǎng)取5mL發(fā)酵種子液,接入盛有45mL無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,每個(gè)處理3次重復(fù)。置搖床中32℃,140r·min-1振蕩培養(yǎng)120h。培養(yǎng)結(jié)束后,取樣測(cè)定活菌生物量(CFU·mL-1)。1.5菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)混皿法,每個(gè)處理3個(gè)稀釋梯度,每個(gè)稀釋梯度5個(gè)平行,32℃培養(yǎng)48h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。1.6發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)1.6.1不同碳源對(duì)菌株發(fā)酵的影響以原始發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的含碳量為標(biāo)準(zhǔn),分別用玉米粉、玉米稈粉對(duì)原始培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行替換,其余組分不變,測(cè)定不同碳源對(duì)優(yōu)選菌株發(fā)酵生物量的影響。1.6.2氮源種類對(duì)發(fā)酵生物量的影響分別用脲0.16g、磷酸氫二銨0.36g、豆餅粉0.75g、磷酸氫二銨0.75g、尿素0.75g以及0.25g豆餅粉+0.052g脲+0.12g磷酸氫二銨的組合對(duì)原始培養(yǎng)基中的氮源進(jìn)行替換,其余成分不變,測(cè)定不同氮源對(duì)優(yōu)選菌株發(fā)酵生物量的影響。1.6.3無(wú)產(chǎn)階級(jí)篩選在原始發(fā)酵培養(yǎng)基中加入無(wú)機(jī)鹽,其余成分不變,測(cè)定不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)優(yōu)選菌株發(fā)酵生物量的影響。1.7分組配比的確定在發(fā)酵培養(yǎng)基配方單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,用均勻設(shè)計(jì)確定培養(yǎng)基各組分的配比,采用4因素7水平7組試驗(yàn)的方式,即U7(74)的設(shè)計(jì)方案,每組試驗(yàn)3個(gè)平行。按1.4進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),用1.5方法測(cè)定活菌生物量,使用DPS軟件進(jìn)行回歸分析。1.8制備農(nóng)藥懸浮液選取目前生產(chǎn)上常用的5種農(nóng)藥,代森錳鋅、代森銨、乙膦鋁、多抗霉素、阿米西達(dá)進(jìn)行放線菌的農(nóng)藥耐受性試驗(yàn)。將農(nóng)藥按所需稀釋倍數(shù)配成溶液,備用。取培養(yǎng)好的菌種用100mL無(wú)菌水洗下,制成孢子懸浮液,備用。向200mL馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中加入10mL上述孢子懸浮液,鋪成平板,待冷卻凝固后,放入牛津杯,并加入上述5種農(nóng)藥的不同稀釋倍數(shù)的藥液,25℃培養(yǎng)3d,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。2結(jié)果與分析2.1生防菌f06-f9對(duì)婦人費(fèi)氏原螯蝦的防效用平板稀釋法共分離到放線菌28株,將初選中有較好拮抗效果的5株放線菌進(jìn)行復(fù)篩。結(jié)果見(jiàn)表1,拮抗菌F05對(duì)西洋參銹腐菌的抑制效果最好,菌落半徑達(dá)到8.52mm,抑制率達(dá)到90.90%。其次F06菌落半徑為9.86mm,F19,F22菌落半徑為14.48,16.56mm,而生防菌F11的防效最差,菌落半徑達(dá)到19.22mm。因此本實(shí)驗(yàn)選擇菌株F05作為發(fā)酵對(duì)象。2.2抗逆反應(yīng)型f052.2.1培養(yǎng)基蛋白的濃度以玉米稈粉為碳源的培養(yǎng)基活菌生物量最多,達(dá)到1.99×108CFU·mL-1。經(jīng)0.01水平顯著性分析,已達(dá)到極顯著水平,其次為麥麩1.19×108CFU·mL-1,玉米粉僅為4.2×107CFU·mL-1。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中加入玉米粉后,培養(yǎng)液會(huì)變得很黏稠,導(dǎo)致溶氧量降低,從而降低了活菌生物量。因此選擇玉米稈粉做碳源。2.2.2氮的來(lái)源以磷酸氫二銨為氮源的培養(yǎng)基活菌生物量最多,已達(dá)到3.03×108CFU·mL-1,經(jīng)0.01水平顯著性分析,已達(dá)到極顯著水平。2.2.3細(xì)菌活菌生物量經(jīng)0.01水平顯著性分析可知,在5種無(wú)機(jī)鹽中,碳酸鈣抑制菌體生長(zhǎng),與對(duì)照相比差異顯著;氯化鈉和硫酸亞鐵與對(duì)照相當(dāng),差異不顯著;而硫酸鎂和磷酸氫二鉀促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng),活菌生物量分別達(dá)到1.87×108,4.07×108CFU·mL-1,差異極顯著。因此,將硫酸鎂、磷酸氫二鉀作為該培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽成分。2.3培養(yǎng)基配方優(yōu)化本試驗(yàn)選用U7(74)均勻設(shè)計(jì)表,考察玉米稈粉、磷酸氫二銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂4種因子不同水平對(duì)F05菌體生長(zhǎng)量的影響,見(jiàn)表2。用DPS軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次逐步回歸分析,得出活菌生物量與各因素關(guān)系的方程Y=-188.3993+150.8510X1-21.0265X12+129.3979X1X3-2458.9638X2X3+55742.1070X3X4,決定系數(shù)R2=0.9991,F=245.5638,P<0.05,該回歸方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為:X1為玉米稈粉3.7206%,X2為磷酸氫二銨0.3003%,X3為硫酸鎂0.0400%,X4為磷酸氫二鉀0.0400%,理論活菌生物量為1.6070×109CFU·mL-1。用相同的試驗(yàn)方法,采用最優(yōu)培養(yǎng)基組分做重復(fù)試驗(yàn),得到活菌生物量15.7×108CFU·mL-1。因此,上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)是合理的,采用均勻設(shè)計(jì)的方法是可行的,能減少試驗(yàn)次數(shù),而且得到最優(yōu)的試驗(yàn)參數(shù)。2.4抑菌圈的測(cè)定5種農(nóng)藥中代森銨、代森錳鋅對(duì)放線菌的生長(zhǎng)均有較強(qiáng)抑制作用,乙膦鋁抑制作用較弱,而多抗霉素、阿米西達(dá)未產(chǎn)生抑菌圈,即這2種農(nóng)藥對(duì)放線菌無(wú)抑制作用。因此,在生產(chǎn)中可將這2種農(nóng)藥與放線菌復(fù)配使用,見(jiàn)表3。3秸稈生物利用技術(shù)本試驗(yàn)在培養(yǎng)基組分篩選時(shí)沒(méi)有考慮精細(xì)原料,而是以粗放原料為篩選對(duì)象,并得到以玉米秸稈為碳源,磷酸氫二銨為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基,為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。據(jù)報(bào)道,我國(guó)每年可生產(chǎn)秸稈7億噸。近年來(lái),秸稈已經(jīng)由傳統(tǒng)的燃料、飼料、肥料變?yōu)橐环N無(wú)用的負(fù)擔(dān)物,進(jìn)而又造成秸稈就地焚燒日趨嚴(yán)重,煙霧彌漫,既污染環(huán)境又嚴(yán)重影響了交通安全。因此,合理利用秸稈十分必要。本實(shí)驗(yàn)以玉米秸稈作為碳源,發(fā)酵放線菌,在實(shí)現(xiàn)對(duì)西洋參進(jìn)行生物防治的同時(shí),也為秸稈的高價(jià)值轉(zhuǎn)化提供了新的思路。關(guān)于氮源的篩選,本實(shí)驗(yàn)從豆餅粉、脲、磷酸氫二