ICS65.020.20DB23佳木斯市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布DB2308/T184—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請(qǐng)注意本文件某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由黑龍江省佳木斯市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件由黑龍江省佳木斯市市場(chǎng)監(jiān)督管理局批準(zhǔn)發(fā)布。本文件起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所。本文件主要起草人：王桂玲、陸文靜、韓笑、周雪松、宋成艷。本文件2023年首次發(fā)布。1DB2308/T184—2023稻瘟病病菌單孢分離培養(yǎng)技術(shù)操作規(guī)范本文件規(guī)定了水稻稻瘟病菌分離所使用的儀器和用具、培養(yǎng)基去雜質(zhì)方法及單孢分離培養(yǎng)程序和方法等技術(shù)規(guī)范。本文件適用于黑龍江省佳木斯市稻瘟病菌單孢分離技術(shù)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB2308/T124-2022稻瘟病菌生理小種鑒定技術(shù)規(guī)程。3術(shù)語(yǔ)和定義3.1稻瘟病由稻梨孢真菌引起的一種水稻病害，又稱稻熱病、火燒瘟、叩頭瘟。病菌侵染葉片、莖稈、穗頸、小穗梗和谷粒。根據(jù)受害時(shí)期和侵染部位不同，可分別引起苗瘟、葉瘟、節(jié)瘟、穗頸瘟和谷粒瘟。3.2單孢分離法由單個(gè)孢子繁殖來獲得純菌種的方法。4儀器和用具4.1常用儀器4.1.1超凈工作臺(tái)潔凈等級(jí)：100級(jí)@≥0.5um。平均風(fēng)速：0.25m/s～0.6m/s。4.1.2高壓滅菌鍋溫度范圍：0℃~135℃,滅菌時(shí)間范圍：4min～120min，最高工作壓力：0.22MPa～0.25MPa。4.1.3恒溫培養(yǎng)箱溫度范圍：0℃~50℃。溫度波動(dòng)：±1℃。光照度：0LX～7500LX。4.1.4光學(xué)顯微鏡2DB2308/T184—20234.1.5電子天平4.2常用用具剪刀、無(wú)菌載玻片、試管、接種針、培養(yǎng)皿、醫(yī)用白瓷盤、濾紙、移液器、醫(yī)用紗布、酒精燈、記號(hào)筆，鋏子。s分離技術(shù)5.1分離方法懸掛震落法分離單孢菌株。5.2培養(yǎng)基的配制酵母淀粉培養(yǎng)基（淀粉10g、酵母粉2g、瓊脂粉20g、蒸餾水1000mL）、瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂粉15g～20g、蒸餾水1000mL），在121℃濕熱滅菌20min。5.3培養(yǎng)基去雜質(zhì)瓊脂質(zhì)量的高低對(duì)單孢的分離有較大的影響。雜質(zhì)少，培養(yǎng)基透明度高，孢子震落后在顯微鏡下易于鏡檢，可提高挑取單孢效率，如果質(zhì)量較差，需采用蛋白去雜的方法（每配制1000mL的培養(yǎng)基，可用一顆雞蛋的蛋清參混。方法是將瓊脂粉煮化后，冷卻至40℃~50℃,加入蛋清，并迅速用玻璃棒攪動(dòng)5min左右，使之成泡沫狀，再重新加熱煮沸，以此瓊脂粉中的雜質(zhì)附著于凝固的蛋白內(nèi)，而后先用1層～2層紗布，將大塊蛋白濾除，再用7層紗布過濾，所得濾液即可裝瓶滅菌備用。）5.4病菌標(biāo)樣消毒取新采集的1cm長(zhǎng)的發(fā)病組織（節(jié)瘟或穗頸瘟）用75%酒精消毒（30s左右），然后用無(wú)菌水沖洗。5.5病菌標(biāo)樣培養(yǎng)在干凈的培養(yǎng)皿中放入1張濾紙或2層吸水紙，加入少量無(wú)菌水（浸濕吸水紙即可把沖洗消毒過的發(fā)病標(biāo)樣放在吸水紙上蓋好后，放在26℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d～2d，標(biāo)樣表面就會(huì)產(chǎn)生深灰色霉層（即孢子）。5.6孢子震落按照DB2308/T124-2022執(zhí)行。5.7單孢鏡檢鏡檢時(shí)將培養(yǎng)皿反轉(zhuǎn)放在顯微鏡的載物臺(tái)上，在10×10倍的顯微鏡下查找稻瘟病菌孢子，同時(shí)在其附近無(wú)其他孢子和雜菌存在時(shí)，用蘸水鋼筆在單孢處輕輕點(diǎn)一墨水小圓點(diǎn)，以小圓點(diǎn)為中心畫個(gè)小圓圈，將點(diǎn)過的小圓點(diǎn)用灑精棉擦掉，再進(jìn)一步檢查所劃圓圈內(nèi)是否是單個(gè)孢子，確定無(wú)其它孢子后，3DB2308/T184—2023再用蘸水鋼筆在單孢處輕輕點(diǎn)一墨水小圓點(diǎn)，在無(wú)菌條件下將所畫圓圈內(nèi)的單孢挑入酵母淀粉培養(yǎng)基5.8單孢提純將瓊脂培養(yǎng)基上的稻瘟病菌單孢接種到酵母淀粉培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)皿上注明菌株編號(hào)、分離日期