特殊環(huán)境樣品中真菌的分離與抗腫瘤活性初步研究

微生物產(chǎn)物是藥物及其遺傳結(jié)構(gòu)的重要來源。豐富的化學多樣性的細菌代謝產(chǎn)物是尋找藥物替代品的主要資源。鑒于從普通環(huán)境微生物中發(fā)現(xiàn)新化合物的幾率越來越小、難度越來越大,我們著手開展了特殊生態(tài)環(huán)境微生物的分離培養(yǎng)及其抗腫瘤活性篩選工作。所得活性菌株直接用于活性產(chǎn)物研究,而無活性菌株則供核糖體工程拓展藥源活性菌株新資源的研究之用。繼以往研究,本文報道從偏遠山區(qū)磚窯內(nèi)部的窯土樣品和潮間帶海泥樣品中野生真菌的分離培養(yǎng)與抗腫瘤活性篩選結(jié)果。1材料和方法1.1培養(yǎng)基和試劑特殊環(huán)境樣品:磚窯窯土樣品采自湖北省巴東縣偏遠山區(qū)的6個不同磚窯內(nèi)部,于2005年11月從各窯內(nèi)不同部位采集;海泥樣品采自天津塘沽驢駒河渤海灣潮間帶,于2004年9月29日清晨4～7時趁退潮至縱深約5km處的潮間帶,在沿海水橫向約10km范圍內(nèi)采集不同地點露天或海水浸泡中的海泥樣品。真菌培養(yǎng)基:真菌固體培養(yǎng)基(葡萄糖2%、瓊脂2%、NaCl1.5%,用200g·L-1馬鈴薯的水煮液配制,pH6.0);液體發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖2%、麥芽糖1%、甘露醇2%、谷氨酸1%、蛋白胨0.5%、酵母浸粉0.3%,用200g·L-1馬鈴薯的水煮液配制,pH6.0)。細胞:人白血病K562細胞株為本所李松教授惠贈。試劑:胎牛血清為北京元亨圣馬生物技術研究所產(chǎn)品;RPMI-1640細胞培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品;鏈霉素為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品;青霉素為中諾藥業(yè)公司產(chǎn)品;MTT試劑為美國Amresco公司產(chǎn)品;實驗中使用的其他試劑均為分析純試劑。儀器:1360B型超凈工作臺為北京亞泰科隆公司產(chǎn)品;MIR-253型微生物培養(yǎng)箱、MCO175型細胞培養(yǎng)箱、MLS-3750型高壓滅菌器和MOV-212型干熱滅菌箱均為日本三洋公司產(chǎn)品;MJX-250C型可控濕真菌培養(yǎng)箱為上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品;ZHWY-2102大型恒溫搖床為上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品;LXJ-ⅡB型離心機為上海安亭科學儀器公司產(chǎn)品;AE31EF-INV型倒置熒光顯微鏡為麥克奧迪公司產(chǎn)品;Labofuge400R型和Biofugefresco型離心機為德國賀力氏公司產(chǎn)品;VERSAMAX-BN03152型酶標儀為美國MD公司產(chǎn)品。1.2實驗方法1.2.1窯土真菌生長真菌的分離純化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基,在配制平板培養(yǎng)基時分別添加青霉素和鏈霉素各50mg·L-1,以抑制細菌和放線菌的生長。取采自不同地點的海泥或窯土樣品各1g,加無菌水10mL,充分振蕩混勻,配制成濃度為100g·L-1的樣品混懸液,吸取該樣品混懸液1mL,加9mL無菌水,稀釋成10g·L-1的混懸液。吸取該兩種混懸液各100μL,分別均勻涂布于平板培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)3～9d。在培養(yǎng)過程中每天觀察真菌的生長情況,待菌落形成后適時挑取形態(tài)不同的單菌落,劃線接種于新的平板培養(yǎng)基上,繼續(xù)在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并從中再次挑取單菌落劃線純化,直至分離得到純菌株。所得菌株接種于相同PDA試管斜面瓊脂培養(yǎng)基上,4℃冰箱中保存并適時傳代。1.2.2發(fā)酵樣品的制備所得真菌的發(fā)酵培養(yǎng)均采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基。將各菌株適量分別接種于含有200mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中,于28℃、200r·min-1搖床發(fā)酵6～10d,根據(jù)微生物生長狀況適時終止培養(yǎng),下?lián)u床得發(fā)酵液。發(fā)酵液中加丙酮至丙酮含量達60%～70%,超聲破碎菌體,離心取上清液,減壓濃縮至不含丙酮,用同體積乙酸乙酯(EtOAc)萃取,萃取液經(jīng)減壓濃縮回收EtOAc,冷凍干燥,得各菌株的發(fā)酵提取樣品。精密稱量適量樣品,用甲醇配成100和10g·L-1的樣品溶液,供篩選抗腫瘤活性。1.2.3樣品處理后測試真菌發(fā)酵樣品的抗腫瘤活性按文獻報道的MTT法用K562細胞經(jīng)樣品處理24h后進行測試。實驗中空白對照和樣品組均設3個孔,取吸光度(A)平均值,以空白對照組為100%按下式計算抑制率(IR):IR(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100%2結(jié)果2.1菌株鑒定結(jié)果從磚窯窯土和海泥樣品中分離得到真菌共計134株,其中,從湖北巴東山區(qū)不同磚窯內(nèi)部窯土樣品中分離得到的陸生真菌32株,從天津塘沽驢駒河渤海灣潮間帶海泥樣品中分離得到的海洋環(huán)境來源真菌102株。各菌株經(jīng)反復傳代和發(fā)酵培養(yǎng)得到不同傳代菌株的發(fā)酵樣品,再用不同傳代菌株的發(fā)酵樣品進行了抗腫瘤活性初篩和復篩,得到在100mg·L-1樣品濃度下對K562細胞有明顯抗腫瘤活性的陸生真菌2株、海洋來源真菌12株(表1)。所得真菌134株從菌落形態(tài)、菌體與孢子色澤以及浸潤固體培養(yǎng)基底部的產(chǎn)物顏色等外觀特征均有顯著差異,其中比較典型且有抗腫瘤活性的4株海洋來源真菌LJW17、LJW26、LJW103、LJW106和2株陸生真菌JZ2、HBL1的形態(tài)照片如圖1所示。2.2微生物活性的穩(wěn)定性在134株真菌初次發(fā)酵樣品的活性初篩中,在100mg·L-1濃度下有明顯抗腫瘤活性的共有14株(表1)。經(jīng)數(shù)次傳代、新傳代菌株的重新發(fā)酵和相應活性復篩,該14株真菌的發(fā)酵樣品均穩(wěn)定重現(xiàn)了抗腫瘤活性,結(jié)果詳見表2。在活性篩選中顯微鏡下可觀測到,部分菌株的發(fā)酵樣品在100mg·L-1濃度下使受試K562細胞發(fā)生顯著的形態(tài)變化,有的呈典型的壞死或凋亡細胞形態(tài)特征,有的呈非正常異型形態(tài)。具有代表性的部分細胞形態(tài)照片如圖2中所示。2.3l-1和土壤中2種活性菌株的生長本文所稱無活性菌株是指發(fā)酵樣品在本文所采用的活性篩選指標下即使在1000mg·L-1的高濃度下也基本不呈現(xiàn)任何抗腫瘤活性的菌株。在初篩和復篩中測試結(jié)果穩(wěn)定重現(xiàn)的共有8株,其中陸生真菌2株、海洋真菌6株,測試結(jié)果見表3。2.4k562細胞中k562活性的檢測其余111株真菌發(fā)酵樣品在100mg·L-1濃度下基本上沒有明顯的抗腫瘤活性,對K562細胞的初篩和復篩抑制率均在10%～20%,當把濃度增至1000mg·L-1時部分樣品的活性雖然有所增加但并不顯著,抑制率均未能超過30%(具體測試數(shù)據(jù)略),這些菌株并未歸于表1和表2中。3菌株活性產(chǎn)物的分離與轉(zhuǎn)化磚窯內(nèi)部長期處于“封門烘烤而高溫燜熱”與“開封?；鸲馗稍铩钡慕惶娓鼡Q狀態(tài),生存于內(nèi)部窯土中的微生物必須適應這種環(huán)境才能得以生存。而潮間帶則作為漲潮為“?！?、退潮為“陸”的陸海交匯處呈“海陸”有規(guī)律地交替變化的特殊生態(tài)環(huán)境,生存于其中的微生物往往也具有與普通陸生微生物不同的特性。這種特殊環(huán)境中的微生物長期生存于相應的獨特生態(tài)環(huán)境中,為適應生存環(huán)境進化具備了與普通環(huán)境微生物不同的代謝途徑,往往能代謝產(chǎn)生活性強而結(jié)構(gòu)新穎的次生產(chǎn)物,已成為倍受重視的新藥篩選資源。本文從湖北巴東偏遠山區(qū)磚窯內(nèi)部的窯土樣品中分離得到真菌32株,從天津塘沽驢駒河渤海灣潮間帶海泥樣品中分離得到真菌102株(陸地與海洋來源真菌共計134株),經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)與活性篩選得到有明顯抗腫瘤活性的窯土來源真菌2株、海泥來源真菌12株。對其中部分活性菌株的活性產(chǎn)物目前正在進行研究,根據(jù)現(xiàn)有進展結(jié)果很有可能得到新活性化合物。這些活性菌株為深入研究活性產(chǎn)物提供了資源。通常在藥源微生物活性菌株的篩選過程中,分離得到的絕大多數(shù)菌株往往因無活性而成無用菌株,造成前期投入的極大浪費和菌株資源開發(fā)利用效率的嚴重低下。因此,在篩選獲取活性菌株的同時,如何將已分離出的無活性菌株有效轉(zhuǎn)化成活性菌株從而拓展藥源微生物資源已成為具有實際意義的重要課題。近來研究表明,無活性放線菌可通過核糖體功能改造代謝產(chǎn)生活性產(chǎn)物,具有轉(zhuǎn)化成藥源活性菌株的潛能,而與改造真菌核糖體功能相關的核糖體工程研究至今未見文獻報道。本文絕大多數(shù)真菌在100mg·L-1的樣品濃度下也都沒有明顯的抗腫瘤活性,在本文抗腫瘤活性指標下基本上不具備用作活性產(chǎn)物產(chǎn)生菌直接用于深入研究的價值。鑒于真菌核糖體工程拓展藥源活性菌株資源研究的挑戰(zhàn)性及其重要意義,本文經(jīng)1000mg·L-1高濃度下的抗腫瘤活性初篩和復篩得到了