ICS

13.020.01CCS

Z

01DB11 DB11/T

2023—2022魚類貝類環(huán)境

DNA

識(shí)別技術(shù)規(guī)范Technical

for

fish

and

identification

usingenvironmental

DNA

發(fā)布

實(shí)施北京市市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB11/T

— 前言.................................................................................

II1

...............................................................................

12

規(guī)范性引用文件.....................................................................

13

術(shù)語和定義.........................................................................

14

..............................................................

25

試劑和器具.........................................................................

26

...........................................................................

47

...........................................................................

58

提取和純化

.....................................................................

59

...........................................................................

610

測(cè)序及結(jié)果分析....................................................................

711

質(zhì)量保證與質(zhì)量控制................................................................

8附錄

A （資料性） 8

堿基條形碼參考序列...............................................

9參考文獻(xiàn).............................................................................

10DB11/T

— 本文件按照GB/T

—《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由北京市水務(wù)局提出并歸口。本文件由北京市水務(wù)局組織實(shí)施。本文件起草單位（北京市水務(wù)局水質(zhì)水生態(tài)監(jiān)測(cè)中心）究中心、首都師范。本文件主要起草人：富晨旺。IIDB11/T

—

1 范圍本文件規(guī)定了DNA（eDNA對(duì)象、技術(shù)方法、采集和實(shí)驗(yàn)術(shù)要求。本文件適用于河流、湖泊、水庫和渠道等地表水域的魚類和貝類識(shí)別。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件款。其中的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件的引用文件本(的修改單)適用于件。GB/T

分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法SL

219

水環(huán)境監(jiān)測(cè)規(guī)范3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1魚類 fish以鰓呼吸、憑上下頜攝食并通過尾和軀干擺動(dòng)以及鰭的生魚綱和硬骨魚綱動(dòng)物的。3.2貝類 shellfish具三胚層、真體腔的軟體動(dòng)物，為底棲動(dòng)物中的重要功能類類（如蚌類、貽和腹足類（如螺類）。3.3環(huán)境

environmental

DNA

從生物生活環(huán)境中直接提取到的不同物種DNA的總和，包含動(dòng)植物脫落的細(xì)胞或游離的DNA提供一個(gè)活物種的存在記3.4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

chain

reaction

一種用于特定DNA的分子生物術(shù)，包括變性、、延伸等主要步驟。DB11/T

—3.5分類操作單元

taxonomic

(OTU)在系統(tǒng)發(fā)或群體遺傳學(xué)研究中設(shè)定的特志鑒別生物單元（品系、種、屬等一般把相似度不小于97%的為一個(gè)物種。3.6引物條形碼 為高通量測(cè)序時(shí)區(qū)分不同樣點(diǎn)來源的物種基因序列，在擴(kuò)增引物5’端增加的序列特異性短片段標(biāo)記。4 魚類貝類

識(shí)別程序魚類貝類1。圖1 魚類貝類

識(shí)別程序5 試劑和器具5.1 試劑除非另有，試劑均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭囼?yàn)用水均使用滿足GB/T

中一級(jí)水要求的新制備的超體：——學(xué)純；——消毒液：和蒸餾水配制，有

5.5%~6.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；DB11/T

———無水學(xué)純，分析純；——75%：無水乙醇和超純水

3:1

配制中用

75%乙醇可使用化學(xué)純無水和蒸餾水3:1

配制；——70%：無水乙醇和超純水

7:3

配制；——乙二胺四乙酸（EDTA）；——?dú)溲趸c（NaOH）；——EDTA

，ρ（）=0.02

：稱取

5.8448

g

EDTA

溶于適量超純水中，NaOH

固節(jié)

至

8.0，定容至

mL，121℃滅菌

18

，冷卻后常溫保存；——EDTA

，ρ（）=0.5

：稱取

14.612

g

EDTA

溶量超中，NaOH

固體調(diào)節(jié)

至

8.0，定容至

mL，121℃滅菌

18

，冷卻后常溫保存；——三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）；——濃鹽酸；——Tris-HCl

溶液，ρ（）=0.1

：稱取

15.76

g

Tris-HCl

溶于適量超中，濃鹽酸調(diào)節(jié)

至

8.0，定容至

mL，121℃滅菌

18

，冷卻后常溫保存；——十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）；——氯化鈉（NaCl）；——CTAB

液：稱取

4

g

CTAB

和

16.38

g

NaCl，分別溶于適量超純水中，加入

EDTA溶液

和

0.1

Tris-HCl

溶液

mL，定容至

200

mL，121℃

18

，冷卻后常溫保存；——蛋白酶

K：酶活力單位為

20；——Tris

飽和酚，pH>7.8；——氯仿；——異戊醇；——酚氯仿：Tris

飽和酚、氯仿和異戊醇按

體配制；——乙酸銨（CHCOONH）；——乙酸銨溶液，ρ（）=7.5

：稱取

g

銨溶于

10

超純水中；——乙酸鈉（CHCOONa·3HO）；——乙酸鈉溶液，ρ（COONa）=3

：稱取

102.06

g

量超中，酸調(diào)節(jié)

至

5.2，定容至

mL，分裝后

121℃

18

；——?jiǎng)游?/p>

DNA

盒：主要包括樣品裂解液、DNA

、DNA

試劑、DNA溶解、純化柱等，提取的

DNA

要求

比值介于

，OD260/230

大于

；——柱式

PCR

產(chǎn)物盒：主要包括

DNA

溶解、純化柱、DNA

、DNA

試劑等，純化的

DNA

OD260/280

比值介于

之間，OD260/230

大于

；——PCR

聚合酶：堿基錯(cuò)配于

；——脫氧核糖核苷三磷酸：脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥嘌呤三磷酸、脫氧胸苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸的等數(shù)混合物（各

2.5×10

），純度>

98%；——三羥甲基氨基（Tris）；——硼酸；——Tris-硼酸電泳液（，5×稱取

g

Tris

和

27.5

g

硼酸溶于適量超純水中，加入

EDTA

溶液

mL，定容至

mL，121℃

18

，溫保存；——瓊脂糖：電泳級(jí)；——溴化乙錠（）；DB11/T

———2.0%瓊脂糖凝膠：量取

5×TBE

緩沖液

20

mL，加入超

和

4

g

瓊脂糖，加熱至瓊脂糖全部融化，，待瓊脂糖膠液冷卻至

℃~60℃時(shí)加入

0.1

，倒入電泳槽中，待膠完全凝固后備用；——DNA

分子量標(biāo)準(zhǔn)品：范圍

0~100

bp。5.2 主要器具具體：——車載冰箱：溫控

4℃及以下；——采樣瓶：1

L，塑料或質(zhì)，具螺旋帽或磨口塞，使

℃滅菌

18

；——微量移液

μL

~2

μL、1

μL

~10

μL、20

μL

~200

μL、100

μL

~1000

μL；——真空抽濾泵及過濾砂芯；——冰箱：溫控℃；——高壓蒸汽可達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的

121℃及

18

滅菌條件；——混合濾膜：

0.45

μm；——手術(shù)剪；——尖頭鑷子；——離心管：

mL，無

DNA

酶；——PCR

管：200

μL；——超微量紫外分度計(jì)：最小測(cè)量體積不高于

1

μL，波長

nm、

nm

和

280

nm，檢出限

2

ng/μL

(dsDNA)；——PCR

儀：溫控范圍

0℃℃，升溫速度

6℃，配套

PCR

管

μL；——低溫離心機(jī)：最高離心不低于

13000

，溫控范圍低至

4℃；——凝膠成像系統(tǒng)：302

光源；——電泳儀：水平式；——電泳槽：水平式。6 水樣采集6.1 采樣點(diǎn)設(shè)置eDNA點(diǎn)的布設(shè)應(yīng)遵循以下原則：a) 主要考慮不同植被覆蓋、水文條件和底質(zhì)特征設(shè)置樣點(diǎn)，兼顧近岸淺域和離岸開闊水b) 湖泊型水體：每

2

km設(shè)置不少于

1

個(gè)點(diǎn)；c) 水庫型水體：入庫河口區(qū)應(yīng)設(shè)置采樣點(diǎn)，庫區(qū)每

km~20

km設(shè)置于

1

個(gè)采樣點(diǎn)；d) 河流型水體：參照

SL

219

中水質(zhì)監(jiān)測(cè)斷面布設(shè)原則設(shè)置；對(duì)

樣品，在采樣斷面上間隔

m

以上等比混合；對(duì)

eDNA

樣品，河流寬度<50

m時(shí)在水域布設(shè)

2

個(gè)采樣點(diǎn)，河流寬度≥

m

時(shí)在水域和中間共布設(shè)

3

個(gè)點(diǎn)，等比混合水樣。6.2 采集方式6.2.1 近岸樣點(diǎn)

eDNA

樣品在

5

m

內(nèi)、不干擾的區(qū)域，

樣品在距岸0.5

m

處人佩戴一次性乳膠手套，將

1

L

的滅菌采樣瓶瓶口向上游來水方向，在距水面下

m

范圍內(nèi)

1

L

水樣。DB11/T

—6.2.2 離岸樣點(diǎn)

eDNA

樣品在水深<10

m

處水面下

m

采集，水10

m

處分水面下

m和水

1

m

兩個(gè)水層等比采集混合水樣；貝類

eDNA

樣品在水

0.5

m

范圍內(nèi)人乘船于船行進(jìn)方向前側(cè)用采水器采集

1

L

水樣，轉(zhuǎn)移采樣瓶中。6.2.3 采樣滿后應(yīng)密封并標(biāo)記，置于

4℃冷藏運(yùn)輸。7 水樣富集7.1 器具消毒7.1.1 宜根據(jù)樣準(zhǔn)備足量器具，統(tǒng)一消毒備用。7.1.2 抽濾廢液瓶需用自來水沖洗，并置于消毒液中浸泡

，取出用自來水沖凈后超純水浸洗

10

，烘干備用。7.1.3 剪刀和鑷子用自來

乙醇清洗，超純水浸洗，烘干備7.1.4 1.5

mL

離心管經(jīng)

121℃

18

，烘干備用。7.2 水樣抽濾7.2.1 連接真空泵和器，用鑷子取

0.45

μm

孔徑的混合纖維素酯濾于玻璃濾膜臺(tái)中央，蓋上抽濾。7.2.2 取

1

L

滅菌超純水進(jìn)行，完成后用鑷子從邊緣夾起濾膜并折疊放入

1.5

mL

離心管中，作為對(duì)照組相同方法抽濾采樣空白對(duì)為對(duì)照組相同方法抽濾各點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)組濁度高造成濾膜堵塞時(shí)應(yīng)及時(shí)更換濾膜，過程應(yīng)避免損失。抽濾中保持器密封，每抽濾完一個(gè)水樣應(yīng)清洗抽濾器并消毒。7.2.3 水樣

4℃冷藏存放不超過

h于采集當(dāng)天完成。7.2.4 抽濾后的濾膜℃中保存，宜在

7

天內(nèi)完成

DNA

提取。8 DNA

提取和純化8.1 DNA

具體：a) 用滅菌剪刀將收集的濾碎至

1

~3

mm的碎片，置于

mL

離心管中；b) 向離心管中加入

750

μL

CTAB

提取液和

μL

蛋白酶

K，渦旋，在

56℃水浴鍋中水浴

3

h，期間

0.5

h

進(jìn)行間斷性；c) 將裂解液轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)編號(hào)的新離心管中，加入等體積

Tris

飽和酚，，4℃、13000

rpm

離心

10

；4d) 轉(zhuǎn)移上清液到對(duì)應(yīng)的新離心管中，加入等體氯仿，，℃、13000

rpm

離心

10

；4e) 轉(zhuǎn)移上清液到對(duì)應(yīng)的新離心管中，加入

2

倍體積冷凍處理的無水和

50

μL

7.5

mol/L的乙酸銨，混勻，℃放置

30

； 4℃、13000

rpm

離心

10

，棄上清液；g) 加入

1

75%乙醇，4℃、13000

rpm

離心

5

，棄上清液；DB11/T

—h) 步驟

g

重復(fù)一次； 室溫晾干，加入

50

μL

無

DNA

酶的超純水溶解； 使用超微量紫外分度計(jì)檢測(cè)總

DNA

和質(zhì)量，利用

2.0%瓊脂糖凝膠電泳

DNA

完整性；k) DNA

：

比值介于

1.8~2.0

之間，OD260/230

；DNA

完整性要求：有單一且清晰明亮的主帶，無大量解。也可中要求的動(dòng)物DNA盒完成，具體操作步驟可參考試劑盒。8.2 DNA

具體：a) 記錄

成果的體積，加入

1/10

體積的

3

乙酸鈉溶液，；b) 向混中加入

2.5

倍體積的無水，混勻；c) 4℃、

rpm

離心

30

，棄上清液；d) 加入

μL

70%乙醇，4℃、

rpm

離心

15

，棄上清液；e) 步驟

d

重復(fù)一次；f) 室溫晾干，加入

a

中

記錄體積的無

DNA

酶超純水溶解。也可中要求的柱式PCR產(chǎn)物成，具體操作步驟可參考試劑盒。9 PCR

9.1 引物選擇和標(biāo)記9.1.1 引物選擇選擇體特定通用擴(kuò)增引物對(duì)eDNA進(jìn)行擴(kuò)增。引物核苷酸：上游引物F：GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC下游引物R：CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG選擇體特定通用擴(kuò)增引物對(duì)eDNA進(jìn)行擴(kuò)增。引物核苷酸：上游引物F：GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC下游引物R：TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA9.1.2 引物標(biāo)記在合成引物前樣點(diǎn)數(shù)量在擴(kuò)增引物5’端添加相應(yīng)數(shù)量的引物條形碼區(qū)分樣點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物。條形碼一般為4、6堿基和8堿基。可參考附錄A中列出的8堿基條形碼參考序列進(jìn)行添加，也可根據(jù)情況自行設(shè)計(jì)添加。不影響擴(kuò)增結(jié)果且測(cè)序后可區(qū)分不同樣點(diǎn)物條形碼均可使用。9.2 PCR

使用中引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系包括PCR聚合酶、聚合酶緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、上下游引物、經(jīng)和8.2提取純化的總DNA、超純水。體積為

μL或其整數(shù)倍，各組分體積PCR聚合酶的要求添加。PCR儀反應(yīng)程序設(shè)置：——預(yù)變94℃

5

；——擴(kuò)增：每個(gè)循環(huán)

94℃變性

s、℃退火

30

s、72℃

90

s，重復(fù)

25

個(gè)循環(huán)；

...DB11/T

———延伸：72℃

10

。4℃保存產(chǎn)物，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。若有特異性目的條帶，用所述再次2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化產(chǎn)物的性，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)純化后的PCR產(chǎn)物質(zhì)量和濃度，同8.1。10 測(cè)序及結(jié)果分析10.1 數(shù)據(jù)篩選理對(duì)PCR擴(kuò)增樣品進(jìn)行第二代高通量測(cè)序，利用分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，去除過程產(chǎn)生的低非特異性擴(kuò)增序列模糊高重復(fù)區(qū)或長度過短的序列，嵌合體序列等）。具體：a) 檢測(cè)測(cè)序數(shù)據(jù)中每個(gè)讀長的引物條形碼，將讀長區(qū)分到不同的采樣點(diǎn)時(shí)去除檢測(cè)引物讀長及錯(cuò)配或測(cè)序錯(cuò)誤生成的序列；b) 去除讀長上的引物，去除錯(cuò)配，此處理后一般僅留存

35~45%的序列；c) 去除不達(dá)，即測(cè)序讀長引起的預(yù)期誤差

0.5

的序列；d) 去除深度較低的序列，即所得總量小于

10×的序列；e) 去除由于讀長限制導(dǎo)致的末端不穩(wěn)定的部分堿基，即序列末端的

5

bp~20

bp；f) 將前后兩端的讀長拼接成一條完整的序列，最低重疊堿基數(shù)一般設(shè)置為

20

；g) 將拼接的序列去重復(fù)處理并排序，同的序列，每個(gè)僅保留一條；h) 對(duì)序列做修剪處理，度不同的序列剪齊，去除序列中包含不確定堿基的部分，去除修剪后讀長過短的序列，保留長度比

PCR

產(chǎn)物長度短

5

bp~10

bp

的序列，低質(zhì)量序列的充分去除； 將篩選和處理后的結(jié)果輸出

格式的序列文件保存。10.2 OTUs

聚類及其物種注釋具體：a) 經(jīng)篩選與處理的測(cè)序數(shù)據(jù)需使用相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件基于

97%序列相似度進(jìn)行聚類，獲得代表生物多

OTUs，并提取其代表性序列；b) 利用相關(guān)軟

BLASTn

功能將聚

NCBI、DDBJ、EBI、

等參考數(shù)據(jù)庫比對(duì)不少于

10

次，篩選出匹配的序列信息；c) 去除低相似度和覆蓋度的結(jié)果，保留

E

值（代表兩個(gè)

eDNA

序列不相關(guān)的小于

10、相似度和

的

OTUs；d) 提取的分類信息，包括界、門、綱、目、科、屬、種等，即可展示待物種信息。10.3 結(jié)果記錄表應(yīng)按表1所列記錄數(shù)理結(jié)果。表1 魚類/貝類

eDNA

識(shí)別結(jié)果記錄表DB11/T

—11 質(zhì)量保證與質(zhì)量控制11.1 采樣和樣品保存具體：a) 每批樣品設(shè)置

1

個(gè)，每個(gè)樣點(diǎn)

3

次水樣；b) 樣品完成后置于

4℃保存、運(yùn)輸并確保在

24

h

內(nèi)完成抽濾，濾膜在℃保存防降解和污染。11.2 樣品前處理具體：a) 抽濾所用器具規(guī)范和清洗，避免樣點(diǎn)間的交叉污染；b) 每批樣品設(shè)置

1

個(gè)；c) DNA

提取和純化所用器具按規(guī)范滅菌，耗材性