蝎毒抗腫瘤作用研究進展

蝎子是世界上最古老的動物之一，已有四年的歷史。東亞鉗蝎(ButhusmartensiiKsrsch)是我國傳統(tǒng)名貴中藥材,中醫(yī)應用已有上千年的歷史。《本草綱目》記載,東亞鉗蝎具有攻毒散結、通絡止痛等功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明,蝎具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛和抗癲癇等多種活性。作者綜述了蝎及蝎毒的抗腫瘤作用研究進展。1東亞蝎子與蝎子毒的腫瘤作用1.1全蟹醇制劑的作用機制張甫同用經乙醇加熱回流法制取的全蝎提取液,注射于帶瘤小鼠的皮下,可以使網狀細胞肉瘤(SRS)和乳腺癌(MA-737)2種瘤組織的DNA明顯減少,并使腫瘤生長得到明顯地抑制。進一步研究表明:全蝎粗提物(全蝎粉經乙醇提取后進一步減壓、濃縮而得)可使體外培養(yǎng)的人體子宮頸癌細胞(Hela細胞)全部死亡脫壁,并且呈現(xiàn)明顯的量-效關系。全蝎粗提物不但對LA-795帶瘤小鼠的腫瘤生長有明顯抑制作用,還可防止其胸腺萎縮,恢復并增強胸腺的免疫功能,停藥后,機體對腫瘤的生長仍有較高的抑制率。全蝎的醇制劑在體外能顯著抑制人肝癌細胞呼吸,并對結腸和人肝癌細胞的生長均有明顯地抑制作用。朱東亞還觀察到:蝎尾提取物(灌胃法)對肉瘤(S180)接種前后的抑制率分別為45.0%和47.6%,而蝎體提取物則無抗腫瘤作用。該結果表明:蝎尾提取物對腫瘤兼有預防和治療的雙重作用。1.2svc對eca129細胞的抑制作用經電刺激等方法采集且未進行純化分離的蝎毒稱為蝎毒粗毒(scorpionvenomcrude,SVC)。董偉華等發(fā)現(xiàn)蝎毒對Eca109細胞具有細胞毒性作用,并抑制Eca109細胞內線粒體脫氫酶的活性,對正常人血淋巴細胞無誘變作用。蝎毒對帶瘤小鼠的腫瘤抑制及延長其生命有重要意義。吳保平等采用大腸癌細胞注入裸鼠脾臟,形成裸鼠移植瘤動物模型,觀察到SVC對裸鼠移植瘤的抗轉移作用。鄭智敏等將東亞鉗蝎SVC加入體外培養(yǎng)的癌細胞體系(人食道癌Eca109細胞株、人宮頸癌Hela細胞株),SVC對Eca109細胞的抑制率和毒性作用分別達38%和60%,但對Hela細胞的作用不明顯;SVC腹腔注射于動物移植性腫瘤-艾氏腹水瘤(EAC)小鼠,表明對EAC小鼠有抑制作用,并能延長荷瘤小鼠的存活時間;將SVC加入自EAC小鼠體內提取的細胞體外培養(yǎng)物中,其對腫瘤細胞的細胞毒性可達84.7%。以上結果說明,SVC對腫瘤有確切的抑制作用,該作用優(yōu)于不能改善荷瘤動物生存時間的化療藥物,也說明SVC對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞并非都有作用,可能有一定的抗癌譜。高春芳等利用鹽酸二甲肼(DMH)誘發(fā)鼠大腸癌模型,研究了SVC對腸癌發(fā)生過程和組織病理改變的作用,結果提示SVC具有去除DMH毒性和直接抑殺腫瘤細胞的作用。蝎毒抗腫瘤的作用機制尚未完全闡明,可能是與蝎毒的如下性質有關:(1)抑制細胞線粒體生物氧化酶活性。SVC能使線粒體脫氫酶活性下降,導致細胞代謝率降低,細胞缺氧,生長抑制甚至因代謝紊亂而死亡。(2)影響細胞的細胞周期。SVC可作為癌細胞的攻擊劑,與DNA特異結合造成DNA斷裂,從而影響了DNA復制;SVC還阻斷G0或G1期向S期的進程,造成G1期細胞堆積,使細胞周期無法進行,從而有效控制了腫瘤細胞的增殖。(3)抑制腫瘤細胞γ-RNA活性,降低AgNOR蛋白含量,使瘤細胞增生減慢。2蝎子毒素的腫瘤成分和作用機制2.1svc和對eca129細胞的急性毒性試驗由于SVC對腫瘤細胞的抑殺作用只是在一定濃度范圍內表現(xiàn)出劑量-效應關系,達一定濃度閾值之后不隨SVC濃度的增加而增強,提示成分復雜的SVC含有影響抗腫瘤成分發(fā)揮作用的物質,因此有必要采用適當?shù)纳锘瘜W方法從SVC中提取純化抗腫瘤有效成分。董偉華等將東亞鉗蝎粗毒經凝膠過濾獲得3個成分:SVC(scorpionvenomcomponents)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,分別處理體外培養(yǎng)的Eca109細胞表明,SVCⅡ、Ⅲ對Eca109細胞有直接殺傷作用,該作用隨濃度的增大而增強,而SVCⅠ對Eca109無作用。由于單一細胞系試驗可能存在的片面性和偏差,采用細胞毒、腫瘤細胞殺傷、集落形成和生長抑制等多種方法,檢測了毒性稍低的SVCⅡ對人喉癌HEp-2細胞和人直腸腺癌C1184細胞的毒性,表明SVC對二者有顯著的抑殺作用,該作用隨濃度增加和作用時間延長而增強,SVCⅡ在高濃度時,生物效應略強于陽性對照藥絲裂霉素。SVCⅡ、Ⅲ也能使線粒體脫氫酶活性下降,導致細胞代謝率降低,細胞缺氧,生長抑制甚至因代謝紊亂而死亡。SVC經進一步純化可獲得抗腫瘤活性較SVCⅡ強數(shù)倍且不良反應降低的蝎毒抗腫瘤因子(AFSVCⅡ),AFSVCⅡ能高選擇性地殺傷腫瘤細胞,減輕化療藥物引起的骨髓造血功能抑制,并增強正常組織對放療的抗輻射作用。2.2apvm在肺癌患者免疫中的應用蝎毒抗腫瘤多肽(antineoplasticpolypeptidefromButhusMatensiiVenom,APBMV)是從東亞鉗蝎中分離的多肽類物質,對人低分化鼻咽癌上皮細胞CNE-2Z、人早幼粒白血病細胞HL-60、人肝癌細胞株SMMC-7211、人胃癌細胞株MCG-803、人食管上皮癌細胞株Eca-109、小鼠肝癌H22和小鼠黑色素瘤(melanomaB16)的生長具有明顯的抑制作用。進一步的研究表明,APBMV并不是單體,高效液相色譜(HPLC)顯示有4個峰。利用分子篩色譜-離子交換技術,經反復實驗,從APBMV中獲得了單一組分AP-Ⅲ。AP-Ⅲ能夠明顯抑制H22的生長,高濃度時的抑瘤率達46.69%。APBMV能夠調動機體的免疫系統(tǒng),抑制腫瘤的生長。APBMV乳劑、針劑及膠囊3種制劑均可抑制腫瘤的生長,促進脾臟功能,升高白細胞數(shù)目及增強機體免疫能力。APBMV使肝癌H22帶瘤小鼠NK細胞活性和DNCB誘導的皮膚遲發(fā)型超敏反應明顯增強,外周血白細胞和淋巴細胞增殖指數(shù)明顯增高,APBMV可對抗或恢復腫瘤對宿主或化療藥導致的免疫抑制或免疫缺損。APBMV經純化后的組分AP-Ⅲ對帶瘤小鼠免疫器官胸腺也具有保護作用。AP-Ⅲ治療腫瘤的同時,亦能維持機體的正常功能狀態(tài)。2.3活性肽的活性東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽(analgesicantitumoralpeptide,AGAP)是劉巖峰在2003年從東亞鉗蝎蝎毒中分離純化得到的單組分活性肽。鉗蝎蝎毒經過6次常規(guī)柱色譜分離純化篩選得到電泳純的活性肽,SDS測定分子質量為7300u。糖蛋白、脂蛋白、核蛋白染色,紫外光譜、熒光光譜、電聚焦等方法驗證活性肽為單一肽鏈的單純堿性多肽,等電點大于10。氨基酸分析表明,活性肽含有較多的堿性氨基酸(這與其等電點大于10相對應),還富含疏水性氨基酸。活性肽的N末端部分氨基酸序列為:VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDE。小鼠醋酸扭體法、熱板法、小鼠S180實體瘤動物模型實驗、小鼠艾氏腹水瘤動物模型實驗表明,活性肽具有較強的鎮(zhèn)痛活性和抗腫瘤活性。小鼠醋酸扭體實驗中,其ED50為0.48mg·kg-1(嗎啡為1.12mg·kg-1),在小鼠艾氏腹水瘤模型中,活性肽劑量為0.6mg·kg-1,療程10d,生命延長率為31.3%;陽性對照藥環(huán)磷酰胺(60mg·kg-1)為15.6%。在小鼠S180實體瘤模型中,劑量為0.6mg·kg-1,療程7d,瘤重抑制率為30.9%,體質量降低1.4g(空白對照降低1.0g);陽性對照藥環(huán)磷酰胺(60mg·kg-1)瘤重抑制率為50.8%,體質量降低5.0g。分別用胃蛋白酶、胰蛋白酶、EndoproteinaseAsp-N、EndoproteinaseGlu-C等水解抗癌鎮(zhèn)痛纈精甘肽,所得樣品在小鼠扭體鎮(zhèn)痛模型中均無鎮(zhèn)痛活性,用二硫蘇糖醇還原活性肽的二硫鍵,其鎮(zhèn)痛活性降為未處理的15%~23%,表明活性肽的生理功能與其一級結構(肽鏈、二硫鍵)的完整性密切相關。活性肽在90℃保溫4h后,其鎮(zhèn)痛活性為未加熱處理的90%左右。預先用嗎啡對小鼠產生藥物依賴性后,活性肽仍然能夠表現(xiàn)出原有的鎮(zhèn)痛作用強度,而且納絡酮不拮抗活性肽的鎮(zhèn)痛作用,表明其鎮(zhèn)痛作用機理可能不涉及阿片系統(tǒng)。根據(jù)測定的部分氨基酸序列,從東亞鉗蝎克隆得到其cDNA(GenBank序列號AF464898),這一序列編碼了19個氨基酸的信號肽,66個氨基酸的成熟肽。用表達載體pET28a在大腸桿菌中表達鉗蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘成熟肽,重組活性肽主要以包涵體的形式存在,表達量約占菌體總蛋白的40%。純化的表達產物(可溶部分)在實驗動物模型中表現(xiàn)出較好的生物活性,作用強度與天然活性肽相當。AGAP成熟肽含有66個氨基酸殘基,從一級結構比對分析的結果來看,推測是Na+離子通道抑制劑,但是AGAP具體的作用機理是什么,還有待于進一步研究。2.4chlusolcin的缺失點及其功能Chlorotoxin是Debin于1991年在蝎(Leiurusquinguestriatusquinquestriatus)的蝎毒中發(fā)現(xiàn)的具有36個氨基酸殘基的短肽,一級結構為MCMPCFTTDHGMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR,它能夠特異性抑制小電導Cl-通道。Chlorotoxin是由一段α螺旋和一個反式平行的β片層組成,含有四對二硫鍵。Chlorotoxin通過抑制該氯通道而能夠特異性并且選擇性抑制神經膠質瘤細胞的遷移與浸潤,而不影響正常腦細胞。進一步研究表明,Chlorotocin在細胞膜上有受體存在,這一受體是基質金屬蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2)。Chlorotixin研究已獲美國FDA批準,開展了1期和2期臨床。131I標記的Chlorotoxin既可以確定Chlorotoxin的生物分布與毒性,還可以用于腦瘤術后患者靶向放療。Chlorotoxin還被用于制成納米探針,用于神經膠質瘤的診斷。東亞鉗蝎中第1個純化出來的Chlorotoxin類似物是Bm-12(也稱為BmKCT)。曾憲春從東亞鉗蝎的cDNA文庫中也篩選得到了同一個多肽的基因。這一多肽由59個氨基酸殘基組成,成熟肽35個氨基酸殘基,其余為信號肽,它的序列與Chlorotoxin有68%的相似性。按照大腸桿菌密碼子合成的Bm-12基因,用pExSecI在大腸桿菌BL21(DE3)中得到表達。重組BmKCTa在N端與蛋白A的IgG結合域ZZ融合表達,重組蛋白被純化至電泳純。在Buthussindicus和Parabuthusschlechteri等蝎種中也有Chlorotoxin類似物發(fā)現(xiàn)。3治療晚期肺癌魏東等用SVC灌腸治療直腸癌患者20例,表明SVC對直腸癌有顯著抑殺作用,且優(yōu)于氟脲嘧啶。蝎毒外用治療癌性潰瘍18例,完全愈合12例,部分愈合4例,穩(wěn)定2例,有效率89%,且不影響外周血象,無肝、腎功能損傷。孫立東等探討了AFSVCⅡ對晚期肺癌的治療作用,治療各種肺癌病患者68例,有效率與聯(lián)合化療組比較無明顯差異,且對患者肝腎功能無損害,明顯改善患者生活質量,這是聯(lián)合化療所不能比擬的。胸腔灌注AFSVC-Ⅱ治療惡性胸水,肝動脈灌注治療晚期肝癌均有一定療效。蝎毒復合膠囊(capsulesofantineoplasticfactorofscorpionvenom,CAPSV)配合放療治療中晚期惡性腫瘤患者84例,其中肺癌13例,乳腺癌23例,鼻咽癌28例,食管癌9例,直腸癌3例,宮頸癌5例,腦腫瘤3例。結果顯示,蝎毒復合膠囊可抑制腫瘤細胞生長,提高放療療效,減輕放療不良反應,保護和增強造血機能,提高機體的免疫功能及改善機體一般狀況。4蟹毒的藥養(yǎng)及作用機制盡管目前有限的實驗和臨床研究表明了蝎毒的抗腫瘤作用,但仍有許多問題有待解決。例如蝎毒抗腫瘤有效成分,抗腫瘤確切機制,體內體外抗腫瘤的差異,臨床試驗中應用途徑、有效劑量和藥動代謝動力學等。最為關鍵的問題的是深入研究蝎毒及有效成分抑殺腫瘤的機制,以此闡明蝎毒對某些腫瘤起作用而對另一些腫瘤沒有作用的原因。蝎毒治療