兒茶素沒食子酸酯egcg茶多酚的分離與純化

茶葉中含有大量多元的酚類化合物，這些物質(zhì)被統(tǒng)稱為茶多酚，占茶葉干重的18%36%。茶多酚具有很強(qiáng)的抗氧化能力,可以作為天然食品抗氧化劑,更重要的是茶多酚還具有防癌抗癌的藥理功能,在醫(yī)藥方面有著光明的前景。作為茶多酚主體成分的兒茶素約占茶多酚總量的70%～80%,其中又以表沒食子兒茶素沒食子酸脂(EGCG)含量最高,占兒茶素總量的50%～60%。大量研究表明,EGCG對肝癌和胃癌具有明顯的預(yù)防和治療效果。所以提取富含兒茶素EGCG的茶多酚和分離兒茶素單體EGCG一直是茶葉領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。但由于兒茶素類化合物物理性質(zhì)十分相近,給提取和分離帶來了難度。目前,提取茶多酚的方法主要有兩種:有機(jī)溶劑萃取和金屬鹽沉淀法;分離兒茶素的方法多種多樣,有采用HPLC分離,HSCCC分離,也有用葡聚糖凝膠分離。本試驗(yàn)對傳統(tǒng)的茶多酚提取方法進(jìn)行了改進(jìn)——在傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取法的基礎(chǔ)上,用等體積的檸檬酸水溶液酸洗,得到富含EGCG的茶多酚,給分離EGCG單體的工廠化生產(chǎn)提供了新的思路和方法;同時把富含EGCG的茶多酚提取與高速逆流色譜(HSCCC)分離兒茶素單體聯(lián)系起來,得到高純度的EGCG,這將有利于EGCG在食品及日用化工領(lǐng)域的廣泛使用。1材料和方法1.1儀器、檢測方法高速逆流色譜(HSCCC,GS10A3型,北京天純維通生物技術(shù)有限公司),高效液相(HPLC,waters、600controller),液相色譜柱(100mm×4.6mm,NuclesilC183μm),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-201,上海申順生物科技有限公司),真空干燥箱(MMMMedcenterEinrichtungenGmbH.D-82166Grafelfing,Germany),電子天平(TB-214,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。1.2儀器和試劑供試茶樣:黟縣條茶(購于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶廠),表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG,TEAVIGOTM),咖啡堿(無錫綠寶有限公司),甲醇(色譜級,TEDIAcompany),乙腈(色譜級,TEDIAcompany),乙酸乙酯(分析純,無錫亞盛化工有限公司),無水Na2SO4(上海東懿化學(xué)試劑公司),檸檬酸(上海東懿化學(xué)試劑公司)。1.3測試方法1.3.1元線性回歸方程分別配置0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1等5個濃度的EGCG溶液,按1.3.3方法經(jīng)液相檢測,以濃度為自變量,峰面積為因變量,進(jìn)行線性回歸分析,求得一元線性回歸方程y=7E+06x+129255(R2=0.9992),同理,咖啡堿峰面積與濃度的回歸方程為y=1E+07x+11445(R2=0.9986)。1.3.2不同萃取方法的提取樣品中檸檬酸的檢測方法為在70℃條件下,用80%的乙醇水溶液浸提茶葉30min,料液比為1∶15,重復(fù)浸提3次。所得到的茶湯在35℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮除去乙醇,然后把茶湯等體積分成6份,分別采用不同方法進(jìn)行處理:1.氯仿萃取1次,乙酸乙酯萃取2次;2.氯仿萃取1次,乙酸乙酯萃取2次,0.9%檸檬酸酸洗2次;3.乙酸乙酯萃取2次,0.9%檸檬酸酸洗2次;4.乙酸乙酯萃取2次,0.9%檸檬酸酸洗1次;5.乙酸乙酯萃取2次,0.6%檸檬酸酸洗1次;6.乙酸乙酯萃取2次,0.3%檸檬酸酸洗1次。所得乙酸乙酯中加入少量的無水Na2SO4靜置脫水,減壓回收乙酸乙酯,然后放入真空干燥箱干燥,分別得到TP-1、TP-2、TP-3、TP-4、TP-5和TP-6。1.3.3樣品的制備方法采用A、B兩相梯度洗脫,A相是2%的乙酸(8%～17.3%),B相是乙腈(92%～82.7%);流速是1.2mL·min-1,時間21min。樣品的制備:分別稱取6種不同提取方法制備的茶多酚和HSCCC分離TP-3得到的EGCG0.01g,用水配成1mg·mL-1的10mL溶液,并經(jīng)過0.45μm微孔濾頭過濾,待測。每次進(jìn)樣量為5μL。1.3.4流動相的配置HSCCC的分離條件:流速為1mL·min-1,泵速為800r·min-1,紫外檢測波長280nm,HSCCC的進(jìn)樣量2mL。流動相與固定相的配置:乙醚、乙酸乙酯、水按一定比例搖勻、靜置、分層,上層是固定相,下層是流動相。樣品制備:分別稱取TP-1、TP-30.2g,溶與2mL的流動相中,其濃度為100mg·mL-1,待分離。1.3.5咖啡堿的計(jì)算公式根據(jù)EGCG的峰面積與濃度的線性相關(guān),得到茶多酚中EGCG含量計(jì)算公式如下,Y是峰面積。同理得到咖啡堿的計(jì)算公式(略)。EGCG/%=Y?1292557E+06×1010×100%EGCG/%=Y-1292557E+06×1010×100%1.3.6ecgg%的測定T=Y?12925510×107E+06×Z0.3×EGCG%×32Τ=Y-12925510×107E+06×Ζ0.3×EGCG%×32式中,Y是EGCG的峰面積,Z是HSCCC對茶多酚分離制備的EGCG,EGCG%是被分離茶多酚的EGCG的百分含量。2不同提取工藝對ecgg得率的影響液相檢測TP-1到TP-6的色譜圖結(jié)果如下。由色譜圖(圖1)可見提取過程中使用氯仿的(TP-1、TP-2)咖啡堿峰要比未使用的(TP-3到TP-6)低,同時使用酸洗的(TP-2到TP-6)EGCG峰要比未使用酸洗的(TP-1)峰高。根據(jù)提取結(jié)果、液相檢測結(jié)果結(jié)合1.3.5計(jì)算方法得到表1。從表1中數(shù)據(jù)結(jié)果看出,提取過程中使用氯仿的(TP-1、TP-2)的咖啡堿含量要比沒有使用氯仿萃取的其他幾組低的多,而其EGCG得率也比其他幾組低,主要是在使用氯仿提取過程中,氯仿易產(chǎn)生乳化,而影響EGCG的得率;提取過程中使用酸洗的(TP-2到TP-6)茶多酚得率要比未使用酸洗的(TP-1)低的多,因?yàn)樵谒嵯催^程中,一些非酯型兒茶素和親水物質(zhì)被洗去,但EGCG的含量基本不變;酸洗的次數(shù)對EGCG的富集也很明顯,用0.9%的酸溶液酸洗2次的TP-3的EGCG含量要比酸洗1次的TP-4高16.75%,但EGCG的得率降低0.13%,所以酸洗的次數(shù)不宜過多;比較TP-4、TP-5、TP-6的EGCG含量,不難發(fā)現(xiàn)酸洗時酸的濃度對EGCG含量的提高有影響,隨著濃度的增加,EGCG的含量增加,但得率卻在降低。為了提取得到富含EGCG的茶多酚,同時又考慮到EGCG的得率,所以選擇TP-3的提取工藝。從分離TP-3的HSCC(圖2)可以看出,TP-3中的4種物質(zhì)A、B、C、D分得較開,根據(jù)HSCC色譜圖2合并相應(yīng)的收集液,分別上HPLC檢測,結(jié)果如圖3。而泵中推出的固定相是表兒茶素沒食子酸酯(圖3E)。把峰D對應(yīng)的液體減壓濃縮,然后真空干燥,得到EGCG干樣0.132g。在同等條件下分離TP-1得到EGCG0.078g。所以,用富含EGCG的茶多酚為原料,HSCCC來分離獲取EGCG單體降低了成本,提高了效率。由圖4可以看出,分離后的EGCG純度要比分離前純度高,根據(jù)圖4中液相色譜圖B中EGCG峰的峰面積7.0×106,結(jié)合1.3.5的計(jì)算方法,可以計(jì)算出HSCCC分離得到的EGCG純度達(dá)到98.2%。再根據(jù)1.3.6的計(jì)算方法,比較分離前后EGCG的絕對量,可知HSCCC分離兒茶素的回收率是87.6%。3ecgg含量對茶多酚含量的影響本試驗(yàn)在傳統(tǒng)的茶多酚提取方法基礎(chǔ)上,應(yīng)用檸檬酸溶液酸洗,除去非酯型兒茶素