-葡萄糖苷酶ec3221研究進(jìn)展

e3。2.1.21歲。它的英文名稱是“界脂魚”，屬于水解酶類。1987年，leebig和wohel首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)，然后在自然界中發(fā)現(xiàn)。它可以來源于植物、微生物,也可來源于動(dòng)物。它的特性是可水解結(jié)合于末端、非還原性的β-D-糖苷鍵,同時(shí)釋放β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基;此外還能微弱地水解對(duì)硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷。根霉能在許多種纖維素物質(zhì)上生長(zhǎng),正是由于它能產(chǎn)生包括β-葡萄糖苷酶在內(nèi)的多種纖維素酶所致。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于β-葡萄糖苷酶的研究,已經(jīng)從單純分離純化分析其酶學(xué)性質(zhì)向采用各種手段,如培養(yǎng)基優(yōu)化或基因工程手段選育工業(yè)化生產(chǎn)用β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株及其實(shí)際應(yīng)用的方向發(fā)展。謝宇,尚曉嫻等研究了來源于曲霉No5.1的β-葡萄糖苷酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)。粗酶液經(jīng)沉淀、柱層析得到純?chǔ)?葡萄糖苷酶,SDS凝膠電泳顯示一條帶,測(cè)得分子量為67.5kD。何可可,薛棟升等采用從海底淤泥中篩選得到的曲霉Aspergillussp.菌株,進(jìn)行固體發(fā)酵生產(chǎn)胞外纖維二糖酶,酶的比活力由10.98U·mg-1提高到131.21U·mg-1。純化得到的纖維二糖酶具有明顯的海洋酶耐鹽和耐熱特性,有更廣的應(yīng)用范圍。瞿麗莉,朱均均等研究了固體發(fā)酵法制備β-葡萄糖苷酶及其在纖維素水解上的應(yīng)用。王冰冰,夏黎明等研究了黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在里氏木霉中的表達(dá),發(fā)酵試驗(yàn)表明,基因表達(dá)產(chǎn)物可以在cbh1信號(hào)肽的引導(dǎo)下順利地向細(xì)胞外分泌。發(fā)酵48h,重組菌株的纖維二糖酶活力可以高達(dá)5.3IU·mL-1,是原始菌株的106倍。李旭暉,朱明軍等建立1種測(cè)定粗纖維素酶中β-葡萄糖苷酶酶活的方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高。1半乳糖苷酶家族根據(jù)氨基酸序列分類,人們將β-葡萄糖苷酶劃分在糖苷水解酶家族1和3中。家族1中的β-葡萄糖苷酶來源于細(xì)菌、植物;家族3中的酶來自真菌、細(xì)菌和植物。家族1中的酶除有葡萄糖苷酶活性外,還有很強(qiáng)的半乳糖苷酶活性。根據(jù)高級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性,糖苷酶家族可以被分成若干部族(Clan),糖苷水解酶家族1屬于“clanGH-A”(superfamily4/7)。其特點(diǎn)是催化結(jié)構(gòu)域具有(β/α)桶狀結(jié)構(gòu),2個(gè)羧基氨基酸參與催化反應(yīng),作為質(zhì)子供體和親核基團(tuán),分別位于第4位和第7位的β折疊上。Moracci等通過比較11種糖苷族1的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)了-N-E-P-和-Y-l-E-N-2個(gè)保守序列,并用定點(diǎn)突變的方法證明了保守序列中的2個(gè)Glu分別是酸、堿基團(tuán)和親核基團(tuán)。也有試驗(yàn)通過自殺底物共價(jià)修飾和定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)證明了這種結(jié)論。23-葡萄糖糖苷酶的理化性質(zhì)和加速反應(yīng)機(jī)制2.1相對(duì)分子量和ph值β-葡萄糖苷酶有胞內(nèi)酶和胞外酶之分,有些生物體內(nèi)只含有胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶,也有的只含胞外β-葡萄糖苷酶,但有少部分微生物體內(nèi)同時(shí)含有胞內(nèi)和胞外β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶的相對(duì)分子量一般在40~250ku之間。不同來源的β-葡萄糖苷酶的相對(duì)分子量由于其結(jié)構(gòu)和組成不同而差異很大。大部分β-葡萄糖苷酶的最適pH值都在酸性范圍,并且變化不大,但最適pH值可以超過7.0,而且酸堿耐受性強(qiáng)。β-葡萄糖苷酶的最適溫度在30~110℃之間,一般來說,來自細(xì)菌的β-葡萄糖苷酶其穩(wěn)定性和最適溫度要高于普通微生物來源的β-葡萄糖苷酶。對(duì)于工業(yè)應(yīng)用來說,酶的熱穩(wěn)定性越高越有利,對(duì)來自嗜熱性和非嗜熱性β-葡萄糖苷酶的分析認(rèn)為,兩者在相互演化過程中的酶修飾作用并不改變酶的活性中心,也不改變其專一性,只是將酶蛋白結(jié)構(gòu)作部分調(diào)整以適應(yīng)高溫環(huán)境。2.2中心也是糖苷酶的底物結(jié)構(gòu)多數(shù)β-葡萄糖苷酶中起催化作用的殘基是兩個(gè)谷氨酸殘基,其中,靠近N端的谷氨酸起酸/堿作用,另一谷氨酸起親核試劑的作用。但Grabnitz等研究發(fā)現(xiàn),來自Clostridiumthermocellum的β-葡萄糖苷酶的活性部分在N端的130個(gè)氨基酸區(qū)域,該區(qū)的個(gè)性特征是氨基酸序列中心基團(tuán)His-Asn-Glu-Pro,存在于該區(qū)域的具有催化作用的殘基是相隔35~55個(gè)氨基酸的His和Glu,其中質(zhì)子化態(tài)的完全保持殘基His121作為質(zhì)子供體與G1u166協(xié)同穩(wěn)定氧碳正離子。而高度保持的C端附近的殘基也許參與了酶與糖苷基底物的鍵合,其中在該區(qū)的一些微小差異與不同β-葡萄糖苷酶的底物特異性有關(guān)。Bauer等對(duì)分別來自嗜熱菌Pyrococcusfuriosus和非嗜熱菌Agrobacterium的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),兩種來源的酶催化反應(yīng)時(shí)按同一種機(jī)制進(jìn)行,即在催化糖苷鍵的裂解反應(yīng)時(shí)都遵循雙取代反應(yīng)機(jī)制。其反應(yīng)方程如下:第1步是酶與底物鍵合成米氏復(fù)合物ES(反應(yīng)速率K1和K-1)。第2步是酶一底物中間體(E-S)的形成(反應(yīng)速率K2);酶的親核基團(tuán)按酸催化機(jī)制進(jìn)攻異頭碳,形成共價(jià)的糖基酶中間體(E-S)。第3步是中間體的水解:由水按堿催化機(jī)制對(duì)異頭碳進(jìn)攻,形成β-葡萄糖基產(chǎn)物并使酶回復(fù)其初始的質(zhì)子化態(tài)。3-葡萄糖酶活性測(cè)定目前對(duì)于葡萄糖苷酶活性的測(cè)定方法很多,概括起來主要有分光光度法、熒光法、電化法等。3.1.1分光光度法3.1.2第1組光的吸收法3.1.4對(duì)硝基苯基-d-葡萄糖苷為酶底物的檢測(cè)另外還有電化法,該方法是以扁桃苷為底物,根據(jù)所產(chǎn)生的氫化物,用與自發(fā)(內(nèi))電解池相聯(lián)結(jié)的一對(duì)銀-鉑電極的發(fā)放測(cè)定其β-葡萄糖苷酶活性。以水楊苷為酶反應(yīng)底物的方法檢測(cè)的是經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解底物產(chǎn)生的極微量的葡萄糖,反應(yīng)易受干擾,且檢測(cè)靈敏度不高。熒光法最初用于酶含量低的高等動(dòng)物組織中的β-葡萄糖苷酶的檢測(cè),靈敏度高且快速,但是由于實(shí)驗(yàn)過程操作復(fù)雜,且重現(xiàn)性不好,現(xiàn)在應(yīng)用不多。以對(duì)硝基苯基β-D-葡萄糖苷為酶底物的比色法最為普遍,且在實(shí)驗(yàn)中該方法操作簡(jiǎn)單,快速,靈敏度高,重現(xiàn)性好。以京尼平苷為底物檢測(cè)β-葡萄糖苷酶活性的方法與pNPG法相比,靈敏度低,但是精密度和準(zhǔn)確度較好,結(jié)果穩(wěn)定。微生物中β-葡萄糖苷酶活性檢測(cè)普遍采用以對(duì)硝基苯β-D-吡喃葡萄糖苷為酶底物的比色法[19~24]。Mcmahon等采用此方法檢測(cè)10株不同的霉菌,其中7株菌株的葡萄糖苷酶活性在575~2650μmol/L,且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好。另外,國(guó)內(nèi)也有采用以水楊酸為底物,然后通過DNS法測(cè)定還原糖含量來計(jì)算酶活性的方法。該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是反應(yīng)生成的極微量葡萄糖,反應(yīng)易受干擾,且檢測(cè)靈敏度不高,誤差大,不適用于植物中低含量葡萄糖苷酶的檢測(cè)。王華夫等用以對(duì)硝基苯基β-D-葡萄糖苷為酶底物的比色法,測(cè)定了不同品種的茶鮮葉β-葡萄糖苷酶活性。江昌俊等以對(duì)硝基苯基β-D-葡萄糖苷為酶底物,研究了茶葉中β-D-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定條件。董尚勝等研究了茉莉花β-D-葡萄糖苷酶活性測(cè)定條件。宋曉青也選用以對(duì)硝基苯基β-D-葡萄糖苷為酶底物的比色法,探討了蠟梅花β-葡萄糖苷酶的活性檢測(cè)方法。4-葡萄糖糖苷的酶固定和應(yīng)用4.1-葡萄糖苷酶的固定化G.Matthijs比較了用相同材料兩種不同固定化方法對(duì)β-葡萄糖苷酶固定化效果的影響:方法1是β-葡萄糖苷酶經(jīng)葡聚糖二醛交聯(lián)后包埋于氨基丙基硅膠中,方法2則將β-葡萄糖苷酶直接包埋在經(jīng)葡聚糖二醛改性的硅膠中,結(jié)果顯示,方法1獲得的固定化酶的熱穩(wěn)定性得到很大提高,而方法2獲得的固定化酶熱穩(wěn)定性較差,究其原因,研究者認(rèn)為,上述2種固定化方法中與載體結(jié)合的酶分子數(shù)不同。YannickG等將β-葡萄糖苷酶固定在DuoliteA-568樹脂中以改善葡萄酒風(fēng)味,結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酶在流化床反應(yīng)器中6h15min后可將葡萄酒中的風(fēng)味前體物100%降解,而在固定床反應(yīng)器中6h40min后可將葡萄酒中的風(fēng)味前體物90%降解,該固定化體系有望在飲料風(fēng)味的改善中得以應(yīng)用。M.Sardar等用pH兩性載體EudragitS-100對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行的固定化研究發(fā)現(xiàn),與游離酶相比,固定化酶km和最適pH沒有顯著變化,但酶活回收率為87%。J.M.Gue6bcmez等將β-葡萄糖苷酶固定于碳納米管中,取得了令人滿意的結(jié)果,12h內(nèi)每克納米管通過靜電作用能夠吸附分子量為135ku的β-葡萄糖苷酶630mg,固定化酶的活力達(dá)400U/g(在試驗(yàn)條件下,每分鐘水解1μmol對(duì)-硝基苯β-D-葡萄糖苷為一個(gè)活力單位)。我國(guó)學(xué)者張正竹等以蠶絲素蛋白為載體,研究了黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的固定化及固定化后酶的性質(zhì);結(jié)果表明,采用共價(jià)法把β-葡萄糖苷酶固定在絲素蛋白膜上,固定后的β-葡萄糖苷酶膜性質(zhì)穩(wěn)定,活力回收率為56.3%,固定化酶的最適pH值沒有明顯改變,但最適反應(yīng)溫度由固定化前的50℃升高到固定化后70℃,酶的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均有明顯提高。4.2不同成分對(duì)胡柚糖苷酶的控制效果Gueguen等用β-葡萄糖苷酶處理桔子、蘋果、葡萄等多種水果汁,再用GC-MS的方法分析酶處理前后主要風(fēng)味成分的變化,結(jié)果表明,芒果、桔子、草莓和蘋果汁的風(fēng)味成分分別提高了1250%,79l%,705%和141%。孫愛東等對(duì)不同來源的β-葡萄糖苷酶酶解橙汁中鍵合態(tài)主要芳香物質(zhì)的效果發(fā)現(xiàn),杏仁酶對(duì)橙汁的鍵合態(tài)組分的酶解效果好于微生物酶,但對(duì)橙皮的作用效果相反;因此,來源廣泛、價(jià)格低廉的微生物酶是適合于工業(yè)化生產(chǎn)的風(fēng)味酶制劑。李平等用感官鑒評(píng)的方法對(duì)β-葡萄糖苷酶處理后的蘋果汁和檸檬汁的風(fēng)味進(jìn)行研究,結(jié)果表明經(jīng)β-葡萄糖苷酶處理過的樣品,除具有樣品本身固有的特征香氣外,香氣組成上更加圓潤(rùn)、柔和、飽滿,增強(qiáng)了感官效應(yīng)。潘利華等將β-葡萄糖苷酶用于胡柚脫苦試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),胡柚中的主要苦味物質(zhì)檸檬苦素和柚皮苷含量有所下降,而且不影響胡柚中Vc含量。Gueguen等用外源β-葡萄糖苷酶直接處理酒精體積分?jǐn)?shù)為0.15的葡萄酒后,用GC-MS分析香氣成分的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶處理樣和對(duì)照相比,香葉醇、苯甲醇、橙花醇、2-苯乙醇和芳香醇分別提高了1200%,1575%,600%,500%和155%。而陳守人等用感官鑒評(píng)的方法,研究了β-葡萄糖苷酶對(duì)干紅葡萄酒風(fēng)味的影響,結(jié)果也表明經(jīng)酶處理的果酒,香氣更加濃郁協(xié)調(diào),風(fēng)味顯著提高。茶葉香氣是茶葉品質(zhì)的重要特征之一。香氣形成機(jī)理研究結(jié)果表明,內(nèi)源糖苷酶對(duì)茶葉花香形成起著很重要的作用。茶葉中β-葡萄糖苷酶的分離純化、特性研究以及外源酶進(jìn)行茶香氣改善試驗(yàn)亦已展開。茶香氣改善試驗(yàn)結(jié)果表明,醇系香氣如芳香醇及其氧化物,香葉醇、橙花醇和苯乙醇等的形成與β-葡萄糖苷酶活性有著密切關(guān)系。隨著酶活性的升高,香葉醇、橙花醇、芳香醇氧化物等以糖甙形式存在于茶葉中的萜烯類化合物均有所增加;脂肪族,萜烯類或芳香族香氣也明顯比游離態(tài)(酶解前)要高。大豆異黃酮共l2種,由大豆苷元、染料木素、大豆黃素3種異黃酮苷元以及它們和乙酰葡萄糖、葡萄糖、丙二酰葡萄糖以β-糖苷鍵形成的9種異黃酮糖苷組成。研究表明,大豆苷元、染料木素、大豆黃素3種異黃酮苷元是大豆異黃酮發(fā)揮藥理功能的活性形式,不具活性的大豆異黃酮糖苷需經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解為活性苷元才能被吸收進(jìn)體內(nèi)發(fā)揮作用。大豆自身含有的內(nèi)源β-葡萄糖苷酶水解活性不強(qiáng),水解效率只有22%~29%。添加足量的高活性酶(如苦杏仁和酵母中提取β-葡萄糖苷酶)可使水解達(dá)到100%。據(jù)報(bào)道,豆奶中添加β-葡萄糖苷酶或接種產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物,都能夠?qū)⒍鼓碳岸鼓谭壑猩镉行暂^低的異黃酮糖苷化合物高效轉(zhuǎn)化為高活性的異黃酮苷元[38~39]。纖維素酶轉(zhuǎn)化纖維成葡萄糖的過程細(xì)節(jié)和作用機(jī)理還不清楚或未有定論。一般認(rèn)為纖維素類物質(zhì)經(jīng)酶促作用轉(zhuǎn)化成葡萄糖至少需要3種酶:內(nèi)切l(wèi),4-葡聚糖酶;外切纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶和外切纖維二糖水解酶把纖維素降解成纖維二糖,它再被β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。纖維素酶作用主要是通過這3種酶協(xié)同進(jìn)行,最后將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖,在這個(gè)過程中β-葡萄糖苷酶起了關(guān)鍵作用。5目前，研究是緊迫的，有必要解決問題，解決途徑和趨勢(shì)5.1生物處理設(shè)備的應(yīng)用因?yàn)棣?葡萄糖苷酶是將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的關(guān)鍵酶,是纖維素酶系中將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的瓶頸,如果能徹底闡明其作用機(jī)理,從而大幅度提高其酶活力,就可以將植物纖維———地球上最豐富的可再生資源,應(yīng)用于發(fā)酵食品工業(yè)原料,對(duì)人類將是一個(gè)重大的貢獻(xiàn)。5.2要建立酶活力的測(cè)定針對(duì)不同來源的β-葡萄糖苷酶分別建立更加簡(jiǎn)便精準(zhǔn)的活力測(cè)定方法體系,同時(shí)規(guī)范對(duì)酶活力的定義,使不同測(cè)定方法之間逐步建立可換算的酶活力單位,從而使不同來源的β-葡萄糖苷酶活力具有可比性,有利于對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行更深入的研究。5.3工業(yè)專利開發(fā)企業(yè)這需要大力開展中試生產(chǎn)研究,將現(xiàn)有的許多實(shí)驗(yàn)室研究成果推向工業(yè)生產(chǎn);探索新的固定化材料和方法,提高固定化酶活性收率,延長(zhǎng)半衰期,降低成本;探索固定化酶在有機(jī)合成生產(chǎn)領(lǐng)域的新工藝。5.4酶解產(chǎn)物的檢測(cè)域更廣,需要在百分多已經(jīng)有關(guān)于β-葡萄糖苷酶和其它酶類協(xié)同作用處理汁、果酒原料等方面的研究,均取得了良好的效果,β-葡萄糖苷酶和其它酶類協(xié)同作用應(yīng)用研究前景,尤其是在食品研究領(lǐng)域?qū)⒏訌V闊。以水楊苷作底物,將水楊苷裂解為水楊醇和葡萄糖,然后將酶解產(chǎn)物中的水楊醇用4-氨基安替比林顯色,再用分光光度法比色測(cè)定;或?qū)λa(chǎn)生的葡萄糖用DNS試劑顯色后進(jìn)行比色測(cè)定;也可用熊果苷(葡萄苷一對(duì)苯二酚)作為底物,對(duì)產(chǎn)生的葡萄糖用碘量法加以測(cè)定。用4-甲基傘形酮β-D-葡萄糖苷作為底物,經(jīng)β-葡萄糖苷酶作用,專一地分解為4-