基因組研究計劃

以南角和稻田為代表的植物因素組的研究取得了迅速進展。目前，已在genak數(shù)據庫中注冊的近三分之一的dna序列（100mb）序列被確定為genak數(shù)據庫。預計2001年，全球合作將完成整個南角樣本鏈的測定工作。隨著植物基因組計劃的實施和進展,GenBank中累積了大量的未知功能的DNA序列,如何鑒定出這些基因的功能將成為基因組研究的重點課題,因此,基因組研究應該包括兩方面的內容:以全基因組測序為目標的結構基因組學(structuralgenomics)和以基因功能鑒定為目標的功能基因組學(functionalgenomics)研究,后者往往又被稱為后基因組(postgenome)研究。功能基因組研究的內容是利用結構基因組所提供的信息,發(fā)展和應用新的實驗手段系統(tǒng)地分析基因的功能。目前人類和酵母的功能基因組研究已經全面展開,尤其是對已完成全基因組測序的酵母來說,其功能基因組研究任務更加緊迫。植物的基因組研究雖然起步較晚,但由于吸取了人類基因組研究中積累的一些經驗,所以進展也相當迅速,對植物功能基因組學的研究目前也已經受到重視,在1998年12月出版的最新一期PlantCell(10:1771)和PlantPhysiol.(118:713)上均編發(fā)了關于植物功能基因組學研究的編者按,并由Bouchez和Hofte(1998)綜述了植物尤其是擬南芥功能基因組學研究的現(xiàn)狀,本文在此基礎上綜述了目前植物功能基因組學研究中使用的主要技術手段以及最新的研究進展。1實驗證據的設置基因的功能主要包括:生物化學功能,如作為蛋白質激酶對特異的蛋白質進行磷酸化修飾;細胞學功能,如參與細胞間和細胞內的信號傳遞途徑;發(fā)育上的功能,如參與形態(tài)建成等。目前,獲得一段DNA序列的功能信息的最簡單的方法是將該DNA序列與GenBank中公布的基因序列進行同源性比較,如利用BLASTn和BLASTx兩種軟件分別進行核苷酸和氨基酸序列同源性比較等。同源性比較的結果大體可以分為如下類型:與生化和生理功能均已知的基因具同源性;與生化功能已知的基因具同源性,但該基因的生理功能未知;與其它物種中生化和生理功能均未知的基因具同源性;雖與生化和生理功能均已知的基因具同源性,但對該基因功能的了解尚不深入,仍停留在表觀現(xiàn)象上。上述同源性檢索分析方法僅僅為該DNA片段的功能提供了間接的證據,對基因功能的直接證據還需要實驗上的數(shù)據。Bouchez和Hofte(1998)將所需要的實驗證據歸納如下:(1)通過研究基因的時空表達模式確定其在細胞學或發(fā)育上的功能,如在不同細胞類型、不同發(fā)育階段、不同環(huán)境條件下以及病原菌侵染過程中mRNA和/或蛋白質的表達的差異等。(2)研究基因在亞細胞內的定位和蛋白質的翻譯后調控等。(3)利用基因敲除(knock-out)技術進行功能喪失(loss-of-function)分析或通過基因的過量表達(轉基因)進行功能獲得(gain-of-function)分析,進而研究目的基因與表型性狀間的關系。(4)通過比較研究自發(fā)或誘發(fā)突變體與其野生型植株在特定環(huán)境條件下基因表達的差異來獲取基因功能的可能信息。2基因組測序計劃通過從cDNA文庫中隨機挑取的克隆進行測序所獲得的部分cDNA的5′或3′端序列稱為表達序列標記(EST),一般長300~500bp左右,利用EST作為標記所構建的分子遺傳圖譜被稱為轉錄圖譜。目前植物EST計劃主要集中在擬南芥[3~5]和水稻上,其他植物的EST相對較少,截止到1998年12月底,在美國國家生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據庫中公布的各種植物EST的數(shù)目總和已達幾萬條(見表1)。這些EST不僅為植物基因組遺傳圖譜的構建提供了大量的分子標記,而且來自不同組織和器官的EST也為基因的功能研究提供了有價值的信息,此外,EST計劃還為基因的鑒定提供了候選基因(candidates)。EST計劃的一個不足之處在于通過隨機測序有時難以獲得那些低豐度表達的基因和那些在特殊環(huán)境條件下(如生物脅迫和非生物脅迫)誘導表達的基因,因此為了彌補EST計劃的不足,必須開展基因組測序計劃。通過分析基因組序列能夠獲得基因組結構的完整信息,如基因在染色體上的排列順序,基因間的間隔區(qū)結構,啟動子的結構以及內含子的分布等。最近,Bevan等(1998)對擬南芥第4染色體上的1.9Mb片段進行了全序列測定,結果發(fā)現(xiàn)擬南芥基因組中平均每4.8Kb就有一個基因存在,而且54%的基因與GenBank中已知功能的基因有同源性,56%的基因可以與GenBank中的EST相對應,大約20%的基因在該染色體片段上以基因家族的形式存在。另外,在該染色體片段中共發(fā)現(xiàn)5種重復成分:非編碼區(qū)中的重復DNA序列、反逆轉座子成分、葉綠體DNA片段、散布重復的基因家族成員,以及串聯(lián)重復的基因家族成員,這些重復成分約占所測序列的19%左右?；蚪M序列測定所面臨的困難是如何將基因的編碼序列與內含子、基因間的間隔序列區(qū)分開來,通常的做法是將所獲得的基因組序列與GenBank中的EST或cDNA序列進行對比以尋找外顯子序列,但是對那些在GenBank中檢索不到同源基因的基因組序列,就必須依賴特殊的計算機軟件進行分析了,常用的計算機分析軟件主要有用于人類基因組研究的GRAIL軟件和植物基因組研究的NetPlantGene軟件,這兩個分析軟件在互聯(lián)網中均可免費使用,其網址如下:GRAIL:/tools/index.shtml;NetPlantGene:http://cbs.dtu.dk//services/NetGene2/。對植物來說,基因組測序計劃還面臨另一個困難,就是植物前體mRNA的剪接機制尚未完全闡明,因而即使利用計算機軟件也很難從基因組序列中推測出基因的編碼序列(外顯子)。植物前體mRNA剪接的機制還因物種而異,如單子葉植物和雙子葉植物前體mRNA的剪接方式就有差別。另外前體mRNA的選擇性剪接(alternativesplicing)方式可能也存在于植物中并對植物的發(fā)育起重要作用。對植物前體mRNA剪接機制的研究目前只在擬南芥中有報道,并積累了一些資料如擬南芥的內含子長度平均只有200bp左右,平均每個基因只有少數(shù)幾個內含子等。因此在大力開展基因組測序的同時,還必須加強對植物前體mRNA剪接機制的研究。3轉錄組研究的內容基因的時空差異表達是植物發(fā)育、分化、衰老和抗逆等生命現(xiàn)象的分子基礎?；蛟诓煌M織、不同器官以及不同環(huán)境條件下的差異表達特征,為基因的功能提供了重要的信息。Velculescu等(1997)將在特定組織或細胞內轉錄的所有基因及其表達豐度稱為轉錄組(transcriptome),因此在轉錄水平上進行的基因表達差異分析實際上就是進行轉錄組研究。經典的減法雜交(subtractivehybridization),差示篩選(differentialscreening),cDNA代表差異分析(representativedifferenceanalysis,RDA)以及mRNA差異顯示(differentialdisplay)等技術已被廣泛用于鑒定和克隆差異表達的基因,但是這些技術不能勝任對大量的植物基因進行全面、系統(tǒng)的分析,于是,基因表達的系統(tǒng)分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)、cDNA微陣列(cDNAmicroarray)和DNA芯片(DNAchip)等能夠大規(guī)模地進行基因差異表達分析的技術應運而生。3.1sagewelle-nblot檢測SAGE技術的主要理論依據是:來自cDNA3′端特定位置的一段9~11bp長的序列能夠區(qū)分基因組中95%的基因。這一段基因特異的序列被稱為SAGE標簽(SAGEtag)。通過對cDNA制備SAGE標簽并將這些標簽串聯(lián)起來,然后對上述串聯(lián)起來的SAGE標簽進行測序不僅可以顯示各SAGE標簽所代表的基因在特定組織中是否表達,還可以根據各SAGE標簽所出現(xiàn)的頻率作為其所代表的基因表達豐度的指標。應用SAGE技術的一個必要前提是GenBank中必須有足夠的某一物種的DNA序列資料,尤其是EST序列資料。目前該技術在人類和酵母基因組研究中已得以應用,但是尚未用于植物基因組研究。SAGE技術的不足是不能夠檢測出稀有轉錄物。3.2生物酶法生物利用技術cDNA微陣列和DNA芯片都是基于reverseNorthern雜交以檢測基因表達差異的技術。二者的基本思路都是首先把cDNA,或EST,或基因特異的寡聚核苷酸固定在固相支持物上,并與來自不同細胞、組織或整個器官的mRNA反轉錄生成的第一鏈cDNA探針進行雜交,然后用特殊的檢測系統(tǒng)對每個雜交點進行定量分析,理論上雜交點的強度基本上反映了其所代表的基因在不同細胞、組織或器官中的相對表達豐度。這兩項技術的優(yōu)點是可以同時對大量基因,甚至整個基因組的基因的表達差異進行對比分析。cDNA微陣列技術是Schena等(1995)發(fā)展起來的,其主要優(yōu)點是:靈敏度極高,mRNA豐度低至10萬分之一仍能被檢測出;使用幾種不同顏色的熒光染料標記探針,這樣在同一張陣列膜上進行一次雜交實驗就可以同時分析不同細胞間或不同環(huán)境脅迫下基因表達的差異。cDNA微陣列技術的主要不足是成本非常高,如需要機器人點膜和特殊的信號檢測分析系統(tǒng),點在玻璃片上的array不能重復使用等。最近,Desprez等(1998)和胡玉欣等(中科院遺傳所,私人交流)分別獨立發(fā)展了利用尼龍膜作固相支持物和使用同位素標記探針進行雜交的cDNA表達陣列技術,從而降低了成本,但檢測的靈敏度卻降低了(萬分之一)。DNA芯片技術是Affymetrix公司率先研制出來的,該技術利用結合化學手段在玻璃固相支持物上原位合成大量的基因特異的寡聚核苷酸,并與熒光標記的探針進行雜交,再利用特殊的檢測系統(tǒng)進行信號分析,就可以獲得基因的時空差異表達譜,最近Ramsay(1998)對DNA芯片技術的原理和應用進行了較全面的介紹,這里不再贅述。3.3蛋白質雙向電泳轉錄不是基因表達的最終結果,基因功能的實現(xiàn)最終是以蛋白質的形式體現(xiàn)的,因此,在轉錄水平上所獲取的基因表達的信息有時并不足以揭示該基因在細胞內的確切功能。蛋白組指的是由基因組表達產生的總蛋白質的統(tǒng)稱,由英文單詞protein的前半部加上單詞genome的后半部組合而成。蛋白質雙向電泳是目前蛋白組研究的首選技術,但是該技術在以下方面尚需改進:分辨率和可重復性;蛋白質斑點的自動定量檢測系統(tǒng),以及蛋白質N端和內部氨基酸序列測定技術等。利用蛋白質雙向電泳技術對基因敲除(knock-out)突變體或轉基因重組體與野生型個體間雙向電泳蛋白圖譜的差異進行對比分析就可以對目的基因的功能進行分析。在植物上該技術已被用來分離新的基因,Damerval等(1998)分析了玉米Opaque2基因的近等基因系之間的雙向電泳蛋白圖譜的差異,結果鑒定克隆了一個新的轉錄激活因子基因。對水稻鹽脅迫處理和ABA處理前后的雙向電泳蛋白圖譜進行的對比分析同樣克隆了幾個與水稻耐鹽性相關的胚胎晚期豐富蛋白(lea)基因。3.4篩選突變體群體傳統(tǒng)的遺傳學或稱為正向遺傳學(forwardgenetics)主要研究自發(fā)或誘發(fā)突變體中某一突變性狀的遺傳行為,如控制突變性狀的基因的數(shù)目及其在染色體上的位置、突變性狀在后代中的傳遞規(guī)律等。反求遺傳學(reversegenetics)是在已知基因序列的基礎上研究基因的生物學功能,一般通過創(chuàng)造功能喪失(loss_of_function)突變體并研究突變所造成的表型效應。在微生物和小鼠中可以通過同源重組的方法用突變的基因取代野生型基因創(chuàng)造功能喪失突變體進行反向遺傳學研究,但在植物中很難進行同源重組試驗,不過植物中有成熟的轉座子標簽(transposontagging)系統(tǒng)和T_DNA標簽系統(tǒng),而且目前已經獲得了擬南芥、金魚草、番茄、玉米和水稻等植物的轉座子插入誘變的突變體群體,以及T_DNA插入誘變了的擬南芥突變體群體。從這些突變體群體中篩選出特異基因被突變了的植株,并對突變株進行表型分析將有助于揭示目的基因的生物學功能。篩選突變體的常用方法是利用PCR技術,這是在果蠅和線蟲(C.elegans)中發(fā)展起來的比較成熟的方法,其基本思路是根據目的基因的序列設計一個引物,再根據插入元件(轉座子或T-DNA)的序列設計第二個引物,用上述引物對突變體群體進行PCR擴增,由于只有目的基因插入轉座子或T_DNA的突變體才有PCR擴增產物,這樣根據擴增產物的有無就可以很容易地從數(shù)以千計的突變體群體中篩選出所需要的突變體。該技術已經在矮牽牛、玉米和擬南芥[28~35]等植物中得以成功應用。但是對數(shù)以千計的材料進行PCR反應工作量十分巨大,為克服這一困難,Winkler等(1998)設計了利用DNA混合池(pooling)進行突變體篩選的實驗程序,結果只需要進行36個PCR反應就可以從由6000個突變體組成的群體中篩選出單個的突變株,大大減輕了篩選的工作量,同時這些突變體的D