級別□國家級口省級編號長春中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目申請書推薦部門 吉林省人參科學(xué)研究院項目名稱清腑潤腸湯改善腸道上皮細胞屏障損傷的作用機制研究項目類型■創(chuàng)新訓(xùn)練項目口創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目口創(chuàng)業(yè)實踐項目所屬一級學(xué)科名稱 藥學(xué) 所屬二級學(xué)科名稱 藥物分析項目負責(zé)人 張若妍申報日期 2023.05二O二三年五月五、導(dǎo)師推薦意見該實驗選題新穎，方案設(shè)計合理，可操作性強，具有一定應(yīng)用價值。申報對象符合要求，同意推薦。簽名:2023年5月9日六、院系推薦意見院系負責(zé)人簽名:學(xué)院蓋章院系負責(zé)人簽名:學(xué)院蓋章年月日七、學(xué)校意見:蓋章年月日注：表格欄高不夠可增加。填表說明一、本表請使用計算機如實準(zhǔn)確填寫各項內(nèi)容。二、《申請書》一式2份，填完后，請用計算機填寫，用A4紙雙面打印，左側(cè)裝訂。三、請準(zhǔn)確、清晰地填寫數(shù)據(jù)表各欄內(nèi)容。項目類型請選擇相應(yīng)條目：創(chuàng)新訓(xùn)練項目、創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目、創(chuàng)業(yè)實踐項目。（1） 1.創(chuàng)新訓(xùn)練項目：本科生個人或團隊在導(dǎo)師指導(dǎo)下，自主完成創(chuàng)新性研究項目設(shè)結(jié)合清腑潤腸湯關(guān)鍵化合物含量與炎癥因子表達水平、細胞膜通透性相關(guān)指標(biāo)等統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果進行關(guān)聯(lián)性分析，闡明清腑潤腸湯對腸道屏障損傷修復(fù)的作用機制。.創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目：本科生團隊在導(dǎo)師指導(dǎo)下，完成商業(yè)計劃書編制、可行性研究、企業(yè)模擬運行、創(chuàng)業(yè)報告撰寫等工作。.創(chuàng)業(yè)實踐項目：學(xué)生團隊在學(xué)校導(dǎo)師和企業(yè)導(dǎo)師共同指導(dǎo)下，基于前期創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目的成果，開發(fā)具有市場前景的創(chuàng)新性產(chǎn)品或者服務(wù)，開展創(chuàng)業(yè)實踐活動。四、本表須經(jīng)項目負責(zé)人所在學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)和主管部門審核，簽署意見并加蓋公章后上報。項目名稱清腑潤腸湯改善腸道上皮細胞屏障損傷的作用機制研究項目類型(J)創(chuàng)新訓(xùn)練項目()創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目()創(chuàng)業(yè)實踐項目項目名稱清腑潤腸湯改善腸道上皮細胞屏障損傷的作用機制研究項目實施時間起始時間：2023年5月 完成時間：2024年5月申請人或申請團隊姓名年級學(xué)院所在專業(yè)班級聯(lián)系電話E-mail主持人張若妍2220級藥學(xué)院藥學(xué)一班@.com成員張文碩222。級藥學(xué)院藥學(xué)一班@,com張君瑜222。級藥學(xué)院藥學(xué)一班@.com指導(dǎo)教師姓名越皓研究方向藥物分析學(xué)年齡46行政職務(wù)/專業(yè)技術(shù)職務(wù)研究員主要成果曾獲吉林省科技進步獎一等獎2項、三等獎1項；吉林省自然科學(xué)學(xué)術(shù)成果一等獎1項、二等獎1項；吉林省拔尖創(chuàng)新人才；全國高等中醫(yī)藥院校優(yōu)秀青年。主持國家重點研發(fā)計劃項目1項；吉林省科技發(fā)展計劃等省級項目10余項；指導(dǎo)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目國家級3項；發(fā)表論文120余篇，其中SCI和EI論文80余篇，獲得授權(quán)專利6項；作為指導(dǎo)教師獲得第十二屆“挑戰(zhàn)杯”中國大學(xué)生創(chuàng)業(yè)計劃競賽銅獎1項，2020年“挑戰(zhàn)杯”吉林省大學(xué)生創(chuàng)業(yè)計劃競賽特等獎1項，第六屆吉林省“互聯(lián)網(wǎng)+”競賽銀獎2項，第七屆“互聯(lián)網(wǎng)+”大賽紅旅賽道國賽銀獎、第八屆“互聯(lián)網(wǎng)+”大賽主賽道國賽銅獎，“吉林北藥杯”二屆全國中醫(yī)藥高等院校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽銅獎1項。一、項目實施的目的、意義便秘是一種發(fā)病率較高、覆蓋人群較廣的胃腸道功能紊亂性疾病，它發(fā)病常呈慢性、進展性，病程較長者可誘發(fā)加重肛裂、痔瘡、結(jié)腸憩室、瀉劑結(jié)腸、肛周疾病及結(jié)腸黑變病等疾病，增加結(jié)直腸腫瘤發(fā)生，誘發(fā)心血管病、腦血管意外等。我國大約有五千萬的成年人存在便秘的困擾，并且便秘的患病率也隨著年齡的增長逐年呈現(xiàn)上升的趨勢。便秘不僅顯著影響患者的生活質(zhì)量，同時也加重了社會醫(yī)療負擔(dān)。目前，藥物依舊是治療便秘的主要途徑，但存在毒副作用大、藥物依賴性強和新型藥物價格昂貴等弊端，因此尋求一種藥物替代品迫在眉睫，深入探索便秘發(fā)病機制、尋找其治療新靶點仍是目前的研究熱點。腸道屏障是由機械屏障、化學(xué)屏障、生物屏障、免疫屏障等所構(gòu)成的具有維持腸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定功能，阻隔外源性有害物質(zhì)進入血液循環(huán)系統(tǒng)的生物結(jié)構(gòu)。近年研究發(fā)現(xiàn)，慢性便秘患者存在腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能改變，故其在便秘發(fā)病中的作用受到廣泛關(guān)注。大承氣湯，主治陽明腑實證、熱結(jié)旁流和里熱實證等，現(xiàn)代研究證明，大承氣湯可改善腸道的黏膜屏障、增強胃腸動力、抑制胃腸道炎癥反應(yīng)，對改善胃腸功能障礙各種臨床癥狀有很好的療效。但作用峻猛，不適用于氣虛陰虧，燥結(jié)不甚者，以及年老、體弱、孕婦等使用，《本草綱目》云“萊瓶子之功，長于利氣。生能升，熟能降?！辈?020年版《中國藥典》記載生地黃具有清熱涼血、滋陰補腎、益精填髓的功效。故加入萊瓶子，地黃等藥材制成清腑潤腸湯。中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)一直是中藥現(xiàn)代化研究的熱點和難點，而中藥復(fù)方化學(xué)成分是重要前提，UPLC-Q-Orb-itrap-HRMS法已成為分析表征中藥成分的重要技術(shù)，而來源于人體結(jié)腸癌細胞株的Caco-2細胞，與正常的人體腸上皮細胞相類似，并且可以分泌與人體相同的轉(zhuǎn)化因子、酶類等，是目前很好的體外腸上皮細胞模型?；谝陨涎芯勘尘?，本項目基于現(xiàn)代制備分析技術(shù)，通過UPLC-Q-Orbitrap-HRMS對清腑潤腸湯的成分進行分析，并在Caco-2細胞單層細胞模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ELISA）與蛋白質(zhì)印跡法（WB）技術(shù)檢測緊密連接蛋白（TJP）與炎癥相關(guān)細胞因子表達水平，探討清腑潤腸湯干預(yù)下對LPS誘導(dǎo)的Caco-2細胞炎癥模型腸道屏障損傷修復(fù)機制，同時為中藥復(fù)方的臨床應(yīng)用及質(zhì)量控制提供參考。二、項目研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題（一）項目研究內(nèi)容：制備清腑潤腸湯供試品，基于數(shù)據(jù)庫信息和相關(guān)文獻，采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法（UPLC-Q-Orbitrap-HRMS）對清腑潤腸湯進行成分分析。建立Caco-2腸上皮細胞單層屏障炎癥性模型，考察給予清腑潤腸湯干預(yù)后模型細胞電阻TEER值、熒光素鈉通過率，光密度0D值、緊密連接相關(guān)蛋白表達、炎癥相關(guān)細胞因子等生化指標(biāo)影響，并對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)合清腑潤腸湯關(guān)鍵化合物含量與炎癥因子表達水平、細胞膜通透性相關(guān)指標(biāo)等統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果進行關(guān)聯(lián)性分析，闡明清腑潤腸湯對腸道屏障損傷修復(fù)的作用機制。（二）擬解決的關(guān)鍵問題：以清腑潤腸湯為研究對象，通過UPLC-Q-Orbitrap-HRMS技術(shù)分析進行化學(xué)成分分析。通過建立Caco-2細胞損傷模型以及檢測腸道屏障相關(guān)緊密連接蛋白表達量等，闡明清腑潤腸湯對腸道屏障損傷修復(fù)的作用機制。三、項目實施方案.清腑潤腸湯的化學(xué)成分分析對照品溶液配制依據(jù)《中國藥典》2020年版，稱取大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸、芥子堿硫氧酸鹽、毛蕊花糖甘、厚樸酚、辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定(千分之一)，加甲醇制備成，溶液，即得作為混合對照品溶液；另精密稱取蘆薈大黃素、大黃素、芥子堿硫氨酸鹽、毛蕊花糖甘、厚樸酚、辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于不同量瓶中，甲醇稀釋至10pig/mL,作為單標(biāo)對照品溶液，均用0.22pm微孔濾膜過濾，備用。供試品溶液配置稱取適量厚樸、枳實、大黃、萊熊子、地黃，加入8倍量蒸儲水浸泡30min,加熱至沸騰狀態(tài)，微沸30min后500目濾布過濾，濾液熱浸lOmin,取藥渣加入6倍量蒸儲水煎煮20min,濾布過濾，熱浸藥渣lOmin,合并2次濾液，趁熱沖入芒硝，攪拌溶解后冷凍干燥，制成生藥量5%的清腑潤腸湯浸膏粉，4℃下保存?zhèn)溆谩＞芊Q取1g,加適量水超聲溶解，精密移取1mL置于50mL量瓶中，甲醇定容，經(jīng)0.22pim微孔濾膜過濾，即得。UPLC-Q-OrbitrapHRMS分析條件色譜條件ThermoDionexUltimate3000UPLCSigmaC18色譜柱(50mmx3.0mmx2.7|im)；流動相水(含0.1%甲酸)(A)-乙晴(B),梯度洗脫(0-5min,2%-18%B；5-10min,18%-21%B；10-20min,21-27%B；20-38min,27%-34%B；38-77min,34%-50%B；77-120min,50%-80%B；120-125min,80%-2%B)；體積流量0.4mL/min；柱溫30℃；進樣量5叱。質(zhì)譜條件ESI離子源參數(shù)：正、負離子FullMS/ddMS?掃描模式；正離子模式下，鞘氣流2.5kV；負離子模式下，鞘氣流速40arb,輔助氣流速lOarb,輔助氣溫度300℃,離子傳輸管溫度320℃,噴霧電壓2.5kV；樣品全掃描質(zhì)譜掃描，掃描范圍m/z100.0-2000.0Da,分辨率70000FWHM；碰撞能NCE為25-55eV。1.4成分鑒定采用Xcalibur4.0軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理分析，通過CompoundDiscoverer3.0軟件將目標(biāo)化合物的一級、二級質(zhì)譜信息與ChemSpider、mzCloud數(shù)據(jù)庫、對照品、參考文獻中化合物的碎片離子峰、碎片裂解規(guī)律進行比對分析，對樣品中的化學(xué)成分進行鑒定。.Caco-2細胞培養(yǎng)取出液氮罐中的凍存細胞，迅速放入37c水浴鍋中，輕輕晃動，待細胞融化后，用DMEM培養(yǎng)液（含10%FBS與1%青-鏈霉素雙抗液）置于37℃、5%CO2環(huán)境下濕化培養(yǎng)。細胞貼壁長至80%時，胰蛋白酶-EDTA液按比例消化傳代，取指數(shù)期細胞接種到transwell小室中，細胞培養(yǎng)3周時，獲得融合的單層細胞。.清腑潤腸湯對LPS誘導(dǎo)的Caco-2上皮細胞屏障損傷的改善機制的研究模型建立與實驗分組實驗分為3組，即空白對照組（control）、模型組（LPS）、供試品組（LPS+清腑潤腸湯），用CCK-8法確定供試品毒性范圍。根據(jù)實驗要求分別在實驗開始后的lh、3h、6h、12h測定TEER,6小時后測定緊密連接蛋白表達。CCK-8法測定不同濃度清腑潤腸湯對細胞活力的影響取對數(shù)生長期Caco-2細胞，調(diào)整細胞濃度為1x105個/mL,于96孔細胞培養(yǎng)板中，為對照組（正常培養(yǎng)）、LPS組（2ng/mLLPS處理24h）、LPS+低劑量供試品組（lOpg/mL清腑潤腸湯預(yù)處理30min,2（ig/mLLPS處理24h）和LPS+高劑量供試品組（40pig/mL清腑潤腸湯預(yù)處理30min,2ng/mLLPS處理24h）。待培養(yǎng)完畢，更換96孔板中的培養(yǎng)液，向每孔加入IOrL的CCK-8溶液，再培育1-2h。用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度，并準(zhǔn)確記錄OD值。計算細胞活力。計算公式：細胞活力一（處理組光密度值/對照組光密度值）X100%單層腸上皮細胞跨膜電阻TEER的測定接種細胞于Transwell小室，實驗前測定跨上皮細胞電阻（transepithelialele--ctriealresistance,TEER）,以驗證細胞融合狀態(tài)和腸上皮屏障的完整性，各組（對照組、LPS組、LPS+供試品組）處理48h,吸去Transwell內(nèi)外的培養(yǎng)液，用HBSS液（pH7.4）沖洗細胞3次，并在37℃孵育30min,重新測量TEER值，TEER值降低不超過原測值的10%,繼續(xù)進行試驗。細胞單層TEER=（實測TEER-空白TEER）xTranswell有效膜面積，單位：Qcm2o熒光素鈉透過性檢測在Transwell頂端腔內(nèi)加入含有終濃度為100|ig/ml熒光素鈉的HBSS液100似,37℃孵育4h,收集腹側(cè)腔液體，在熒光分光光度計下測定吸光度（激發(fā)波長427nm,發(fā)射波長536nm）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算透過到基底側(cè)熒光素鈉的濃度。Westernblot檢測腸上皮細胞緊密連接Occludin、claudin-1和ZO-1蛋白取各分組共培養(yǎng)24h蛋白，加入loadingbuffer煮沸90s使蛋白質(zhì)變性，取20ul蛋白進行SDSPAGE凝膠電泳，250mA恒定電場下將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉4c封閉過夜，加入相應(yīng)的一抗室溫孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次lOmin。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育lh,TBST緩沖液洗膜3次，每次lOminoECL法顯色后進行結(jié)果分析。采用ImageJ軟件分析Western-blot灰度值。清腑潤腸湯對Caco-2細胞因子IL-1B、TNF-a、IL-6和IL-10濃度的影響按照ELISA試劑盒操作說明，測定IL-1B、TNF-a、IL-6和IL-10細胞因子質(zhì)量濃度。統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)均使用“平均值土標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SPSS