環(huán)境中微生物的生物多樣性

在地球生物圈中，微生物在氣候形成、地理變化、地化循環(huán)和生物進(jìn)化過程中發(fā)揮著重要作用。然而，只有少數(shù)能夠引起人類疾病或物種的微生物產(chǎn)品被人類認(rèn)識，大多數(shù)微生物沒有被人類理解和使用。20世紀(jì)80年代以前,大多數(shù)微生物多樣性和微生物活性研究都是通過純培養(yǎng)后進(jìn)行生理、生化性質(zhì)的確定來實(shí)現(xiàn)的。到目前為止各實(shí)驗(yàn)室通過純培養(yǎng)方法已經(jīng)獲得了數(shù)千種細(xì)菌、病毒和近10萬種真菌,但自然界中絕大多數(shù)微生物由于不能被培養(yǎng)而沒有得到基本的認(rèn)識。過去30年中的基因組技術(shù)發(fā)展和在環(huán)境微生物研究中的廣泛應(yīng)用,已經(jīng)極大地促進(jìn)了對微生物遺傳多樣性、群落結(jié)構(gòu)和微生物生態(tài)功能的了解,拓展了對未知世界的認(rèn)識,本文就近年來環(huán)境基因組技術(shù)應(yīng)用于微生物多樣性的研究進(jìn)展作一個簡要的綜述。1srrna基因分析技術(shù)據(jù)估計(jì):地球上原核生物的總數(shù)大約是在4×1030~6×1030之間,由106~108種組成,它們構(gòu)成了生命的最大儲存庫,是地球上僅次于昆蟲的第二大類群的生物。微生物可培養(yǎng)性極低,到目前為止能通過純培養(yǎng)得到的微生物低于通過顯微鏡觀察到的微生物的1%,如土壤微生物的可培養(yǎng)率為0.3%、淡水微生物的可培養(yǎng)率為0.25%、海水微生物的可培養(yǎng)率為0.001%~0.1%、活性污泥中微生物的可培養(yǎng)率較高為1%~15%。Chattopadhyay的研究亦表明水生生態(tài)系統(tǒng)中許多微生物不能被培養(yǎng),Staley認(rèn)為通過純培養(yǎng)得到的微生物在實(shí)際生態(tài)系統(tǒng)中并不是數(shù)量最多、功能最重要的微生物體,Orphan也認(rèn)為純培養(yǎng)技術(shù)對于研究已分離鑒定微生物的生理功能非常有用,但不能反映實(shí)際的微生物群落組成。因此對于微生物多樣性研究,傳統(tǒng)的方法已無法滿足研究的需要,找到能克服純培養(yǎng)的限制、能對樣品進(jìn)行客觀而準(zhǔn)確的分析方法成為微生物多樣性研究中的熱點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,尤其是16SrRNA基因分析技術(shù)的運(yùn)用,使得不需要培養(yǎng),直接在環(huán)境樣品中確定微生物的種、屬組成、微生物群落結(jié)構(gòu)成為可能。Worse等利用ssurRNA將微生物分為古細(xì)菌、細(xì)菌和真核微生物三部分,即著名的“三域?qū)W說”,在這個進(jìn)化體系中,可培養(yǎng)微生物構(gòu)成了12個主要的門,自那以后Rappe等利用16SrRNA基因的序列測定,確定了另外可培養(yǎng)微生物的14個門和不能被培養(yǎng)微生物的26個門。自此在原核生物的52個分類門中,有一半還沒有純培養(yǎng)出代表種。微生物多樣性包括物種多樣性、遺傳多樣性、功能多樣性等等,在物種以上水平,多樣性通常以從特殊環(huán)境中得到的微生物分類類型之間的進(jìn)化距離來量化;物種以下水平,多樣性以基因多樣性和遺傳多樣性來描述;而在物種水平以物種多樣性來代表微生物多樣性。種是生物分類的基礎(chǔ),是在不同層次描述、理解、比較不同生境生物多樣性的關(guān)鍵,然而對微生物來說,“種”的概念較模糊,因?yàn)閭鹘y(tǒng)的“種”的概念是建立在生殖隔離的基礎(chǔ)上的,絕大多數(shù)微生物屬于無性繁殖,微生物之間容易進(jìn)行遺傳物質(zhì)的交換,因而給種的概念在微生物研究中的應(yīng)用帶來了困難。微生物分類學(xué)家將菌株之間的DNA-DNA匹配率≥70%定義為同一個種,Amann通過16SrRNA基因序列測定以及DNA-DNA雜交研究表明:DNA-DNA匹配率為50%時對應(yīng)的16SrRNA基因的同源性高達(dá)99%,因此微生物學(xué)家認(rèn)為如果從環(huán)境樣品中提取到的16SrRNA基因與已知基因的同源性<95%,可以確定為是一個新種。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)直至2006年10月6號來自GeneBank數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)表明:該數(shù)據(jù)庫收錄了來自可培養(yǎng)的原核生物83614條16SrRNA基因和不可培養(yǎng)的原核生物180249條16SrRNA基因,反映了微生物物種的極大豐富性。微生物多樣性的時空分布由微生物種群的遺傳性和生物地理作用所決定,許多環(huán)境因子如溫度、pH、鹽度、營養(yǎng)、能量與碳的來源等等都影響微生物的活性和微生物的時空變化,如Triplett等研究了Wisconsin30個湖的微生物群落組成與11個環(huán)境影響因子之間的關(guān)系,揭示湖泊所處地域以及湖泊性質(zhì)是導(dǎo)致微生物群落不同的主要因素。雖然16SrRNA基因分析提供了大量的有關(guān)環(huán)境中微生物種、屬信息,但對不同微生物群落的功能和群落整體的遺傳信息揭示較少,因此對微生物生境中整個基因組進(jìn)行分析得到了迅速發(fā)展,環(huán)境基因組技術(shù)由于適合分析生態(tài)系統(tǒng)中整個復(fù)雜的微生物基因組,并空前地研究了基因組的異質(zhì)性和進(jìn)化性而成為了新的研究領(lǐng)域并迅速發(fā)展起來。2境基因組信息庫篩選轉(zhuǎn)化子環(huán)境基因組(Metagenomics)也稱為元基因組或宏基因組,是一種對微生物群落進(jìn)行非培養(yǎng)的基因組分析技術(shù),即從環(huán)境中提取總DNA,對其進(jìn)行遺傳學(xué)和功能學(xué)上的研究技術(shù)。整個實(shí)驗(yàn)過程包括:從環(huán)境樣品中直接提取DNA→用核酸內(nèi)切酶將DNA消化后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)妮d體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞→構(gòu)建環(huán)境基因組文庫→篩選轉(zhuǎn)化子(如圖1)。雖然環(huán)境基因組中所涉及的技術(shù)已經(jīng)存在了很多年并且是分子生物學(xué)研究中的常規(guī)技術(shù),但用于分析未知的環(huán)境DNA樣品產(chǎn)生了許多令人激動的研究成果,為人類認(rèn)識未培養(yǎng)微生物世界提供了有效的途徑。例如Kirchman用構(gòu)建大插入片段的環(huán)境基因組文庫、16SrRNA基因PCR文庫、原位雜交3方法研究了Delaware河的細(xì)菌DNA,通過比較發(fā)現(xiàn)環(huán)境基因組文庫可以檢測出用其它非培養(yǎng)方法檢測不到的細(xì)菌。通常環(huán)境基因組文庫中的各種克隆可通過系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因,或通過其它的利用雜交技術(shù)和多種PCR技術(shù)得到的保守基因來篩選,也可通過直接對克隆進(jìn)行隨機(jī)測序以及通過表達(dá)菌體特有的性狀如酶活性或菌體產(chǎn)生的抗體產(chǎn)物等來篩選。這些篩選方法各有優(yōu)缺點(diǎn),為此幾種篩選方法相結(jié)合有利于提高對環(huán)境微生物多樣性的全面揭示。根據(jù)研究方法的不同,環(huán)境基因技術(shù)組分為兩大類:即基于測序分析的環(huán)境基因組技術(shù)和基于功能分析的環(huán)境基因組技術(shù)。2.1環(huán)境基因組的研究基于測序的分析技術(shù)是利用保守的DNA序列來設(shè)計(jì)雜交探針和PCR引物以便從環(huán)境基因組文庫中篩選出研究者所感興趣的基因,通常是將含有系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因的克隆進(jìn)行完全測序或進(jìn)行隨機(jī)測序來了解非培養(yǎng)微生物在分類群中的遺傳潛能。一旦感興趣的基因被確定,在DNA側(cè)翼處搜索系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因就能夠提供系統(tǒng)發(fā)育與功能基因之間的聯(lián)系,了解到微生物的功能信息。16SrRNA和Nif、RadA/RecA基因是最常用的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因,其它的如編碼DNA解旋酶、tRNA合成酶、熱激蛋白質(zhì)70等基因也包含種系發(fā)生的信息,也可以作為系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因來進(jìn)行分析,因此隨著系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因數(shù)量的增加和多樣性的提高,基于測序的分析技術(shù)將進(jìn)一步得到廣泛應(yīng)用。環(huán)境基因組技術(shù)在早期主要用于非培養(yǎng)微生物的系統(tǒng)發(fā)育起源分析,用于了解環(huán)境微生物的系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究。Delong研究團(tuán)體首次利用該技術(shù)得到了非培養(yǎng)的古細(xì)菌群基因組序列,隨后他們在細(xì)菌文庫中鑒定到了海洋細(xì)菌γ-Proteobacteria,通過16SrRNA的側(cè)翼DNA序列分析表明γ-Proteobacteria廣泛含有能產(chǎn)生視紫紅質(zhì)的基因,由于視紫紅質(zhì)能對光做出反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)滲透的跨膜電位,因此具有光驅(qū)動質(zhì)子泵的重要作用。以前的研究僅僅了解到只有喜鹽類古細(xì)菌才能產(chǎn)生視紫紅質(zhì),Delong等的研究結(jié)果表明視紫紅質(zhì)基因不僅存在于古細(xì)菌中也廣泛存在于γ-Proteobacteria中,由于γ-Proteobacteria廣泛存在于海洋系統(tǒng),因此可以推測海洋細(xì)菌的光合氧化作用,從而具有全球性的重要意義。另外一個重要的例子為——乳桿菌門是一類在土壤中分布很廣、含量較大的微生物,分為8個屬,通過純培養(yǎng)只能得到8屬中的其中3屬乳桿菌,大部分非培養(yǎng)乳桿菌沒有得到研究,通過對乳桿菌基因組文庫中的大小為500kb的DNA序列進(jìn)行完全測序,揭示了乳桿菌門的遺傳多樣性,并從大量序列信息中如乳桿菌中含有與Streptomyceslincolnensis相類似的直接與林可霉素合成途徑有關(guān)的操縱子,以及乳桿菌中含有編碼環(huán)型的β-1,2-葡聚糖合成酶的同源基因等等推斷出了乳桿菌的生理、生態(tài)作用。在研究群落內(nèi)微生物的功能、微生物的分布以及微生物基因組的結(jié)構(gòu)和特性、水平基因轉(zhuǎn)移等方面的關(guān)系時,大規(guī)模的隨機(jī)測序非常有用。例如2004年構(gòu)建了酸性礦水和Sargasso海非培養(yǎng)微生物的基因組文庫,對得到的克隆進(jìn)行了大規(guī)模隨機(jī)測序,結(jié)果不但獲得了大量的新穎基因而且大大豐富了對不可培養(yǎng)的微生物群落的了解。2.2功能基因組技術(shù)微生物功能基因組學(xué)研究不僅要闡明微生物基因組內(nèi)每個基因的作用或功能,還要研究基因的調(diào)節(jié)及表達(dá)方式,進(jìn)而從整個基因組及其全套蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能、機(jī)理的高度去了解微生物生命活動的全貌,揭示微生物世界的各種前所未知的規(guī)律,并使之為人類和社會服務(wù)?；诠δ艿沫h(huán)境基因組技術(shù)首先是將能夠表達(dá)某一特定性狀的克隆子確定下來,然后通過測序和生化分析來進(jìn)一步認(rèn)識微生物,該技術(shù)的最大特點(diǎn)是可以將能夠表達(dá)某一功能的克隆確定下來。功能基因組包括許多方法,常常利用微生物的可選擇表型如對某種抗生素的抵制作用和微生物在某種特定底物中才能生長等來進(jìn)行分析,有利于從上百萬克隆中篩選出活性克隆子。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不需要通過序列分析來認(rèn)識基因,不受已知基因的同源性序列限制,且獲得的基因往往結(jié)構(gòu)很新穎,甚至是一些新的基因家族成員,并具有了解已知和未知功能的所有基因類型的潛能。缺點(diǎn)是許多基因在特定的寄主細(xì)菌中不能表達(dá),異源性表達(dá)的不足仍然是從功能基因組分析中得到最大信息量的障礙。通過功能基因組技術(shù),多種抗生素如terragine、turbomycinA/B,acyltyrosines等,Na+(Li+)/H+運(yùn)載蛋白、具有生物合成功能的酶和多種水解、降解酶等許多活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)。如Elend等從土壤環(huán)境基因組中獲得了酯酶EstCE1并從飲用水環(huán)境基因組中獲得了酯酶EstA3,這兩種酶均由380個氨基酸組成,都屬于酯酶家族的VIII類,酯酶EstA3的最適作用溫度為50°C,最適作用pH為9.0,酯酶EstCE1的最適作用溫度為47°C,最適作用pH為10.0,這些酶具有高度的穩(wěn)定性和底物的高度專一性,使得這些酶在生物技術(shù)應(yīng)用中非常有利。目前利用功能基因組技術(shù)得到的活性物質(zhì)的頻率較低,例如對德國某地土壤微生物基因組文庫研究發(fā)現(xiàn)730000個克隆中只有1個克隆具有解脂的功能;對美國某地土壤微生物DNA文庫進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)25000個克隆中只有29個克隆具有溶血活性;活性克隆的缺乏需要發(fā)展有效的篩選和選擇新活性物質(zhì)和分子的方法,高通量篩選方法是有效篩選的基礎(chǔ),如選擇能以羥基丁酸鹽為唯一碳源和能源生長的克隆可篩選到新的降解酶。環(huán)境基因組文庫的功能篩選已經(jīng)導(dǎo)致了大量“假定蛋白”在數(shù)據(jù)庫中的功能分配,環(huán)境基因組文庫中基因表達(dá)的增大能發(fā)現(xiàn)自然界更多的產(chǎn)物,因此進(jìn)一步方法的改進(jìn)一方面要克服異源基因表達(dá)的不足;另一方面要有效地從巨大的文庫中檢出稀有克隆,大文庫的建立是為了能夠代表復(fù)雜環(huán)境的所有微生物基因組;也可通過尋找多個表型來聚積活性克隆數(shù),以此來發(fā)展環(huán)境基因組技術(shù)。3微生物指標(biāo)應(yīng)用目前,環(huán)境基因組技術(shù)在微生物多樣性研究中主要應(yīng)用于底泥微生物、水生微生物、廢水微生物和土壤微生物等幾個方面。為此,本文就以上幾個方面的典型案例介紹如下。3.1底泥和水體的病毒環(huán)境病毒絕大多數(shù)感染微生物,是最豐富的生物體,Wilhelm和Suttle(1999)認(rèn)為海洋中的病毒數(shù)超過了1029,它們在微生物食物鏈內(nèi)物質(zhì)和能量的轉(zhuǎn)移中起著重要作用。Breitbart利用環(huán)境基因組技術(shù)對海洋非培養(yǎng)病毒的兩個群落進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在獲得的1061個序列中65%與數(shù)據(jù)庫中的已知序列不相似,具有較大的病毒多樣性,進(jìn)一步對底泥進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)底泥中病毒多樣性更大,序列的75%與數(shù)據(jù)庫中已知序列不相似,估計(jì)1kg底泥中含有10000種基因型不同的病毒。比較底泥和水體的病毒環(huán)境基因組發(fā)現(xiàn),底泥樣品中的序列與長尾噬菌體有著更高的相似性,通常溫度越高長尾噬菌體的出現(xiàn)頻率越大,暗示底泥中有著更大的細(xì)菌溶源性,在底泥中噬菌體之間、噬菌體與細(xì)菌之間有著更普遍的遺傳物質(zhì)的交換性。David等通過構(gòu)建環(huán)境基因組文庫研究了南極海洋500m深處的古細(xì)菌門GroupII,對大小為39.5kbp的基因片段進(jìn)行了測序及分析,發(fā)現(xiàn)這個基因組片段組織緊湊,在類似大觀霉素操縱子內(nèi)有一些重疊基因,大多數(shù)開放閱讀框編碼的蛋白參與包括管家作用在內(nèi)的許多功能。3.2sargasob基因生物地球化學(xué)循環(huán)的結(jié)構(gòu)Venter等對位于大西洋百慕大附近的受營養(yǎng)限制的Sargasso海微生物環(huán)境基因組進(jìn)行了研究,通過2000000次的隨機(jī)測序得到了由16億個堿基對組成的原始序列,其中包含了1000000kb以上的非重復(fù)序列和1200000個新基因。結(jié)果顯示這些DNA片段至少來自1800類不同的基因組,包括148個以前未知的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育類型。他們的研究也確定了細(xì)菌物種豐富度的空間變化和不同取樣點(diǎn)的相對豐度。研究發(fā)現(xiàn)794061個基因?qū)儆诠δ芪幢幻鞔_的蛋白基因,69718個基因參與能量傳遞,其中782個基因編碼視紫紅質(zhì)蛋白。這一發(fā)現(xiàn)比現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)的視紫紅質(zhì)蛋白基因提高了幾乎10倍,表明在Sargasso海該類型的光合氧化作用很重要。該研究進(jìn)一步提高了對海洋生態(tài)系統(tǒng)的生物地球化學(xué)循環(huán)的了解,首先傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為海洋的硝化作用是被細(xì)菌所介導(dǎo),而作者發(fā)現(xiàn)大量古細(xì)菌中具有銨單氧合酶(ammoniummonooxygenase),暗示古細(xì)菌也能參與硝化反硝化作用;其次Sargasso海環(huán)境基因組還包括一些其它的基因,這些基因與受磷酸鹽限制的極端生態(tài)系統(tǒng)中存在的能利用多聚磷酸鹽和焦磷酸鹽的基因相類似,表明Sargasso海中的微生物也能充分利用多聚磷酸鹽、焦磷酸鹽甚至無機(jī)磷、碳磷酸鹽化合物,因此在磷缺乏的環(huán)境中由于具有了以上功能的基因大大提高了它們的生存機(jī)會。由于與C、N、O、H、S循環(huán)相比,人們對磷怎樣進(jìn)入生物系統(tǒng)并改變氧化狀態(tài)等方面了解很少,因此該海環(huán)境基因組的研究有利于了解磷循環(huán),研究磷吸收和磷轉(zhuǎn)換的機(jī)制,甚至通過環(huán)境基因組及功能物種的研究提高了人們對營養(yǎng)循環(huán)的理解,研究結(jié)果暗示將來自環(huán)境微生物群落的DNA重新構(gòu)建完整的基因組文庫并利用鳥槍法測序是未來研究微生物生態(tài)的極好方法。3.3環(huán)境基因組序列及生物生態(tài)學(xué)Tyson等對加州Richmond礦排出的酸性廢水微生物進(jìn)行了基因組分析,Richmond礦是一個富含F(xiàn)eS2的礦山,礦山廢水表面漂浮著粉紅色微生物的生物膜,生物膜中微生物的氧化作用導(dǎo)致了大量硫酸的產(chǎn)生,使得礦山廢水的pH為0~1之間,通常礦山廢水的Fe、Zn、Cu、As等含量高,溫度高達(dá)42℃,廢水排入江、河后導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境問題。該研究團(tuán)體直接從生物膜樣品中提取DNA,構(gòu)建插入片段為3.2kb的文庫,采用鳥槍測序法對DNA進(jìn)行隨機(jī)測序,得到了長為78Mb的DNA序列,確定了4000個假定基因,構(gòu)建了LeptospirillumII型細(xì)菌和Ferroplasmaacidarmanus型古細(xì)菌的完整基因組,同時也獲得了LeptospirillumIII、FerroplasmaI、G-plasma的部分基因組序列。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示酸礦廢水生物膜微生物群落多樣性較低,群落由少量的物種組成,基因組重排和基因插入、刪除發(fā)生頻率較低。由于每個序列來自不同的個體,揭示了單核苷酸多態(tài)性是菌株水平異質(zhì)性的主要形式。通過對環(huán)境基因組序列的生物信息學(xué)分析了解了上述5類原核生物在酸礦廢水中的生態(tài)作用。(1)揭示了許多參與CO2和N2的固定基因和鐵的代謝基因。絕大多數(shù)微生物通過乙酰輔酶A途徑實(shí)現(xiàn)碳的固定,LeptospirillumIII中含有大量與固氮基因同源的基因,由于LeptospirillumIII在群落中的豐富度較低(10%)和特殊的固氮作用,LeptospirillumIII被認(rèn)為是酸性礦水中的關(guān)鍵物種。Leptospirillumspp.和Ferroplasmaspp.都參與對鐵的氧化,有著不同的電子傳遞鏈,尤其是Leptospirillumspp.含有大量編碼假定的對氧具有高親和力的細(xì)胞色素基因,使得Leptospirillumspp.在能量轉(zhuǎn)化、維持較低的氧分壓、保護(hù)含固氮酶微生物等方面具有重要作用,Ram在2005年證實(shí)了該地細(xì)胞色素蛋白的大量存在。(2)Ferroplasmaspp.種群中具有許多編碼運(yùn)載氨基酸、糖的蛋白基因,可能在環(huán)境中運(yùn)輸各種有機(jī)物。(3)基因組序列數(shù)據(jù)確定了許多基因的遺傳多態(tài)性,給出了Ferroplasmaacidarmanus種群內(nèi)基因重組的證據(jù)。3.4土壤環(huán)境基因組多態(tài)性土壤是比水生生態(tài)環(huán)境更為復(fù)雜的生境,土壤微生物棲息在土壤的表面和土壤顆粒形成的微孔中,就微生物的分布和生長條件來說,土壤環(huán)境極度不均一,使得土壤微生物的多樣性大大超過其它生境的微生物多樣性。據(jù)估計(jì):每克土壤中包含了100億個左右的微生物細(xì)胞,這些細(xì)胞可能屬于幾千甚至上百萬個物種,據(jù)估計(jì)土壤環(huán)境基因組可能包括20~2000Gbp的DNA序列,但只有0.1%~1%能被培養(yǎng),如果不考慮稀有的和沒發(fā)現(xiàn)的微生物基因組,土壤微生物群落的大小可能是大腸桿菌基因組的6000~10000倍左右。如果重新構(gòu)建的DNA文庫要能夠真正代表整個土壤樣品的基因組,則需要106個插入片段大小為100