植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象

20世紀初，德國植物生理專家哈維納提出了植物細胞全能性理論，成為現(xiàn)代生物技術的重要組成部分。它在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、醫(yī)藥等方面發(fā)揮著顯著的作用。雖然植物組織培養(yǎng)過程并不復雜,但在實驗和生產(chǎn)過程中常常會遇到一些問題,重者會導致試驗和生產(chǎn)的失敗,給科研和生產(chǎn)造成損失。本文針對組織培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)的幾個問題提出相應的防止措施。1.培養(yǎng)基的紅色褐變是組織培養(yǎng)中常遇到的問題,外植體在培養(yǎng)過程中,自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質,使培養(yǎng)基逐漸變成褐色,外植體也隨之進一步褐變而死亡的現(xiàn)象。1.1外植體的褐變植物組織培養(yǎng)過程中的褐變現(xiàn)象是由多種因素綜合產(chǎn)生的結果,隨植物的種類、基因型、外植體生長部位以及生理狀態(tài)、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等的不同而不同。豆科植物和蕓苔屬植物在原生質體培養(yǎng)中容易發(fā)生褐變是一個普遍性問題,在蕓苔及其衍生種或變種中的褐化問題尤為嚴重。王永清等(1997)曾在櫻花于不同培養(yǎng)基中生長狀況的比較中發(fā)現(xiàn),1/4MS在一定程度上能減輕櫻花外植體的褐變。培養(yǎng)條件如溫度、光照等對褐變均有影響。溫度過高或光照過強,都可以提高PPO的活性,從而加速被培養(yǎng)組織的褐變。外植體的褐變是一種酶促褐變,這一點已為大多數(shù)的學者認可。植物組織培養(yǎng)中褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物多少和多酚氧化酶(PPO)活性有關。特別是木本植物都含有較高的酚類化合物。正常條件下,酚類化合物分布在細胞的液泡內,酚酶分布在各種質體或細胞質內,這種區(qū)域性分布使得底物多酚類化合物與多酚氧化酶(PPO)被質膜分隔開來,因而比較穩(wěn)定。在建立外植體時,細胞膜的結構被破壞,酚類化合物外溢,在溢出過程中與多酚氧化酶發(fā)生氧化形成棕褐色的醌類物質和水,醌類物質又會在酪氨酸酶等的作用下,與外植體組織蛋白中的蛋白質發(fā)生聚合,形成黑褐色物質(羥醌與黑色素等),引起褐變發(fā)生。1.2防止棕櫚樹1.2.1不同切割長度對組織培養(yǎng)苗成活率的影響由于所選擇的外植體材料的年齡、取材部位、材料大小等均能對褐變產(chǎn)生影響。Chevre分析了歐洲栗的酚類含量的變化,結果表明,幼齡材料酚類化合物含量少,而成齡材料比較多。當莖尖小于0.5mm時,褐變達70%以上,而隨著切割長度增大,褐變減輕;以莖尖8~15mm褐變較輕,組織培養(yǎng)苗成活率達87%。此外,外植體受傷害程度直接影響褐變,切割時應盡可能減小傷口面積,并縮短切口在空氣中的暴露時間。1.2.2對褐變的控制作用將易褐變的外植體材料放在黑暗條件下培養(yǎng)一段時間,連續(xù)轉移,可以減輕褐變。李煥秀等用6種不同的預處理來研究其對蒼溪梨外植體褐變和成活的影響,結果發(fā)現(xiàn),低溫處理對降低褐變有一定作用。用抗氧化劑或PPO溶液進行預處理也可起到減輕褐變的作用。1.2.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對外植體分化的影響培養(yǎng)基的狀態(tài)、組成、生長調節(jié)物質及組合等要適宜,溫度、PH值要盡量調整到褐化物分泌最少的狀態(tài)(酸性環(huán)境不利于褐變的發(fā)生);大多數(shù)植物種類要求pH值在5.0~6.0。適當降低培養(yǎng)基的PH值可以降低多酚氧化酶的活性和底物利用率,從而抑制褐變。張妙霞等(1999)在進行柿樹組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),改良的MS培養(yǎng)基能促進外植體分化,減輕外植體的褐變程度。培養(yǎng)基中加入的生長調節(jié)物質不當,也會使外植體產(chǎn)生褐變。張衛(wèi)芳等(2003)在對一年生薄殼核桃的莖尖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)基中6一BA濃度的升高,褐化率隨之增高,褐化反應時間也提早;較低濃度的6一BA適宜莖尖的分化生長,褐化反應慢,部分培養(yǎng)基已無明顯褐化現(xiàn)象;添加2,4-D、IAA的組合中,褐化反應稍有推遲。培養(yǎng)過程中還要注意適宜的培養(yǎng)條件。因為在酚類物質的合成和氧化過程中,有許多酶系統(tǒng)參與,其中部分酶系統(tǒng)是光活性的。由于較強的光照和較高的溫度,都可以提高PPO的活性從而會使酶促褐變加強。所以建議在培養(yǎng)初期保持較低的溫度(15~0℃),黑暗或弱光下培養(yǎng),均可減輕培養(yǎng)材料的褐變。1.2.4氯社會體對酚類物質的吸附組織培養(yǎng)時,在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和其他抑制劑可抑制外植體的酶促褐變。在培養(yǎng)基中加入Vc可有效地防止褐變。一方面可以使多酚氧化酶失活阻止酚類物質氧化;另一方面Vc在酶的催化下能消耗溶解氧,使酚類物質因缺氧而無法氧化。在培養(yǎng)基中加入吸附劑可以抑制褐變?；钚蕴渴俏叫暂^強的無機吸附劑,但在使用過程中,應盡量使用最小濃度來防止褐變,因為活性炭的吸附作用是無選擇性的。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質的專一吸附劑,常用作酚類物質的保護劑來防止褐變。2.組織畸形,為等重離子生長玻璃化現(xiàn)象是指在培養(yǎng)過程中材料呈半透明狀,組織結構發(fā)育畸形的現(xiàn)象,又稱過度水化。玻璃化的苗由于組織畸形,分化能力降低,不易成活。因此不宜用作繼代和移栽的材料。2.1玻璃制造迄今為止,對于玻璃化的成因尚無定論,目前認為玻璃苗的形成可能有以下幾方面的原因。2.1.1培養(yǎng)基中各化學成分的變化試管苗培養(yǎng)過程中,光照、溫度、濕度、pH值均間接影響著玻璃化的發(fā)生。培養(yǎng)時光照遠較自然環(huán)境下弱,一般僅為1000~3000lx,培養(yǎng)器皿內相對濕度過高,氧氣供應逐日下降,CO2濃度逐漸上升,培養(yǎng)基中各化學成分往往開始濃度過高而后又供應不足。肖玉蘭等研究發(fā)現(xiàn),光照度在l0O00~20000lx范圍內,隨著光照度提高,玻璃化苗顯著減少。降低培養(yǎng)溫度、相對濕度,提高pH值也可有效防止玻璃苗發(fā)生。2.1.2制約外植體生長的物質培養(yǎng)的植物種類、外植體類型及大小顯著影響著玻璃苗的發(fā)生。外植體越幼小,玻璃苗發(fā)生機率越大,這可能是外植體的較老組織中含有防止玻璃苗產(chǎn)生的物質,或者是較大外植體的分生組織遠離培養(yǎng)基表面,而使其生長環(huán)境的水分狀況得到改善。周菊花發(fā)現(xiàn)瑞香外植體取材部位顯著影響玻璃苗發(fā)生頻率,對枝條而言,取芽和莖基之間的中段莖作外植體易發(fā)生玻璃化現(xiàn)象。2.1.3植物外源激素對植物碳源的影響許多研究表明,瓊脂的成分變化對玻璃苗的形成有重要影響。戴桂林等發(fā)現(xiàn),由于瓊脂中Ca、N、Mg、Mn、Fe、B、Zn等含量的差異,導致玻璃苗發(fā)生率明顯不同。瓊脂在固體組織培養(yǎng)中作為凝固劑,它的主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固,使用濃度常為0.6%~0.8%。一般認為,瓊脂含量低容易導致玻璃化現(xiàn)象發(fā)生。糖在植物組織培養(yǎng)中作為碳源,為細胞提供合成新化合物的碳骨架,同時可以維持一定的滲透壓,與玻璃苗發(fā)生率呈顯著負相關。關于植物外源激素,普遍認為較高的細胞分裂素易于誘發(fā)玻璃苗形成,而且BA+NAA比KT+TBA的激素組合更易誘發(fā)玻璃苗形成,且隨著濃度升高,玻璃化率升高。外源赤霉素和乙烯對玻璃化的發(fā)生沒有顯著影響。2.2玻璃苗的外植體培養(yǎng)措施隨著對玻璃化產(chǎn)生機理研究的深入,某些植物的玻璃化已得到了有效的控制。而且研究發(fā)現(xiàn),玻璃化現(xiàn)象只是一種表現(xiàn)特征,玻璃化的組織在一定條件下,可以恢復為正常苗。在控制玻璃苗發(fā)生時,一般可采用如下措施:①選不易玻璃化的基因型及部位做外植體。②適當提高光照強度,改善培養(yǎng)材料的通氣狀況;固體培養(yǎng)時,增加瓊脂使用濃度,降低培養(yǎng)基中的水勢,可以有效地降低玻璃苗的發(fā)生頻率。③培養(yǎng)基中增加K、P、Fe、Cu、Mn、zn元素的含量,降低B含量,增加硝態(tài)氮,降低銨態(tài)氮。④選擇適宜的糖源及外源激素種類和濃度,并注意生長素與分裂素的配合,在未出現(xiàn)嚴重玻璃化之前,適當降低激素特別是細胞分裂素類激素的用量,可以減少玻璃苗的出現(xiàn)。⑤添加有機物,如添加根皮苷,可有效地抑制玻璃苗形成。添加植物激素合成前體如ACC等,對防止蘆薈玻璃化有效。3.污染和預防3.1污染原因在組織培養(yǎng)中污染經(jīng)常發(fā)生,其原因也是多種多樣,可歸結為兩個方面:一是接種前和操作過程的污染;二是接種后的污染。3.1.1接種時各高、專場消毒接種前的污染一是接種室環(huán)境雜菌含量過高。二是接種時各器具滅菌時間短,操作沒有嚴格按照要求進行。另外,接種人員自身消毒不嚴。此類污染可通過完善操作、培養(yǎng)環(huán)境,嚴格操作程序來克服。3.1.2外植體帶菌污染原因。據(jù)外部植接種后真菌大面積污染可能原因一是接種室的孢子過多或超凈臺的濾布不潔。二是外植體消毒處理不完全。對外植體帶菌引起的污染,情況比較復雜,與外植體的種類、取材季節(jié)、部位、預處理方法及消毒方法等密切相關。三是繼代、生根培養(yǎng)等階段培養(yǎng)物的轉接操作比較粗糙,將微生物帶入培養(yǎng)瓶內,引起新的污染。操作人員無菌意識不強、無菌操作技術不熟練也是一個重要因素。3.2防止污染的措施針對以上原因,對整個組織培養(yǎng)工作進行改進,采取了如下一些措施。3.2.1紫外消毒處理經(jīng)常對接種室進行空間消毒。用70%的酒精噴霧降塵消毒,用消毒水擦試地面、墻壁、工作臺等;用紫外線照射消毒;用甲醛加少量的高錳酸鉀熏蒸滅菌。(甲醛用量4~6ml/m3,高錳酸鉀3~6g/m3。)使用前打開超凈工作臺紫外燈,照射20-60min;操作前10min使超凈工作臺處于工作狀態(tài),讓過濾空氣吹拂工作臺面和四周臺壁,然后關閉紫外燈,用70%的酒精擦拭工作臺面,以確保工作臺處于無菌狀態(tài)。3.2.2消毒保鮮技術外植體的選擇要以污染少易啟動(易培養(yǎng))為原則。如植物胚不易被污染且具有幼嫩的分生組織細胞是常用的外植體。在用莖尖作外植體時,可在室內或無菌條件下對枝條進行預培養(yǎng),如將枝條用水沖洗干凈后插入無糖的營養(yǎng)液或自來水中,使其抽枝,然后以這種新抽的嫩枝條作為外植體,污染率可下降到20~30%。在選擇莖段進行組織培養(yǎng)時,可采用2次滅菌法,如將月季莖段用70%酒精浸泡30S。以0.1%升汞處理8min,無菌水沖洗5次后,再用2%的次氯酸鈉液消毒10min,在無菌水沖洗3~5次后接種,效果較好。所以要想取得理想的無菌材料,除精選材料外,要求操作人員嚴格按照無菌操作順序操作。對材料內部帶菌的組織,在培養(yǎng)基中加入適量抗生素,以達最佳消毒效果。田永亮等在葡萄組織培養(yǎng)接種初期使