分子生物學(xué)

PBL第一次討論Contents1.人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取2.RT-PCR的原理、方法3.瓊脂凝膠電泳結(jié)果分析及應(yīng)用人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取

真核細(xì)胞質(zhì)總RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）組成，其rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。

人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取·分析不同發(fā)育時期基因的表達(dá)狀況·獲得新基因AIMS·研究基因的拼接·分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物

人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取原理：RNA的不穩(wěn)定性

由于核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解

RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性，不易失活。所以需要RNA酶抑制劑來抑制RNA酶的活性，從而達(dá)到成功提取RNA。人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取常用RNA酶抑制劑：

焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。

異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。

氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取

RNA提取的一般步驟：破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA

破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、蛋白酶K等破碎組織

加入β-巰基乙醇可以抑制RNA酶活性

分離RNA一般用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開

沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH=5.2）或異丙醇。

人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取

④洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解

⑤融解RNA一般使用TE（三羥甲基氨基甲烷和EDTA配置而成）

⑥保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase（核糖核酸酶）的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存也應(yīng)該如此

RT-PCR

的原理及方法

RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴增。

RT-PCR

的原理及方法

背景

基因的表達(dá)