環(huán)磷腺苷葡氨和氨茶堿聯(lián)用對小鼠急性缺氧性腦損傷的干預作用

缺氧和窒息是一種非常常見的病理生理過程。缺氧發(fā)生后，損傷最嚴重的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是嬰兒。近年來研究表明在腦損傷急性期,腦組織內(nèi)環(huán)磷腺苷(cAMP)水平顯著下降,其參與了腦缺氧損傷的病理機制。MCA和氨茶堿可防止缺氧引起的cAMP下降,提高細胞內(nèi)cAMP水平。本實驗采用急性缺氧性腦損傷(HBI)小鼠模型,探討MCA、氨茶堿及兩藥聯(lián)合應用對HBI的神經(jīng)保護作用及可能機制。材料和方法1.氨茶堿組MCA(黑龍江江世藥業(yè)有限公司);氨茶堿(廣州白云山明興制藥有限公司);SOD、MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。2.小鼠的瓶塞觀察3周齡昆明小鼠90只(購自南方醫(yī)科大學動物中心),雄性,體重18-22g,放入含有新鮮空氣、經(jīng)過標定的廣口瓶中,瓶內(nèi)預置10g鈉石灰,以涂凡士林的瓶塞密封,觀察小鼠的表現(xiàn),當小鼠出現(xiàn)呼吸困難時打開瓶塞。3.測定指標及方法小鼠隨機分為正常對照組、HBI組、MCA組、氨茶堿組、MCA+氨茶堿組,每組18只(其中6只測腦組織含水量,6只測生化指標,6只用于病理切片);MCA組予濃度為MCA5mg/kg+生理鹽水5ml/kg,氨茶堿組予氨茶堿5mg/kg+生理鹽水5ml/kg,合用藥組予氨茶堿5mg/kg+MCA5mg/kg,HBI組注射等量的生理鹽水,各組采用腹腔注射給藥,2次/日,72h后斷頭取腦,取材測各項指標。4.濕重的測定鼠斷頭取腦后,濾紙擦去表面殘血,在電子天平上稱出濕重后,置80℃恒溫干燥箱中至恒重,再稱干重。根據(jù)以下公式計算腦組織含水量:腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重X100%。5.sod和mda斷頭取腦稱重,用無菌生理鹽水作為勻漿介質(zhì),按1g:9ml在冰浴中充分勻漿,離心后取上清,SOD采用黃嘌呤氧化酶法測定,MDA應用改良的硫代巴比妥酸法測定,操作按說明書進行。6.海馬組織形態(tài)觀察斷頭取腦,分離海馬組織,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片,片厚5微米;HE染色,普通光鏡下觀察海馬組織形態(tài)變化;400倍顯微鏡視野下觀察,以周圍出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象的細胞為調(diào)亡細胞,計數(shù)6個視野內(nèi)調(diào)亡細胞數(shù)。7.統(tǒng)計學處理方法實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗、單因素方差分析,比較組間差異;兩兩比較采用LSD法,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異非常顯著。結(jié)果1.各組腦的含水量比較與正常對照組相比,氨茶堿組可明顯減少腦組織含水量,合用組次之。藥物干預組腦組織含水量減輕較HBI組減輕。(見表1)2.組不同高度的時域適用差異合用組MDA的含量與正常對照組比無顯著差異;與HBI組相比,藥物干預組腦組織內(nèi)MDA的含量明顯降低,以兩藥合用最明顯(見表1)。3.近覆蓋近覆蓋與正常對照組相比,合用組SOD的活性最接近正常值;與HBI組相比,藥物干預組腦組織中SOD活性明顯升高,以兩藥合用為著(P<0.01),但仍低于正常水平(見表1)。4.各組腦組織病理學變化(1)大量縮亡細胞,觀察細胞病變HBI組海馬結(jié)構(gòu)紊亂,細胞排列散亂,可見大量萎縮及調(diào)亡細胞,膠質(zhì)細胞增生;MCA組、氨茶堿組海馬病理改變較HBI組減輕,尤以兩藥合用組為顯著,見下圖。(2)兩組調(diào)亡細胞數(shù)變化HBI組海馬CA1區(qū)細胞凋亡數(shù)顯著增加;藥物干預組調(diào)亡細胞數(shù)減少,其中,聯(lián)合用藥組較單一用藥組調(diào)亡細胞數(shù)明顯減少(P<0.01,P<0.01)。促進細胞調(diào)亡作用近來的研究表明腦缺氧時存在腦組織cAMP的代謝紊亂,其參與了腦缺氧/缺血損傷的病理機制。缺氧時,腦組織短暫的缺氧缺血即可引起ATP的急驟減少;另一方面由于嚴重的缺氧也可損害腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng),使腺苷酸環(huán)化酶的活性降低或受抑。兩者共同作用使細胞內(nèi)cAMP水平下降。Pourcyrous研究了窒息后腦脊液中cAMP的變化規(guī)律,認為窒息后前20mincAMP迅速增至基線3倍以上,20-40min時降至基線,恢復早期(60min時)cAMP又有所上升,隨著繼續(xù)恢復,cAMP降至基線值50%左右而不再變化。cAMP作為第二信使參與神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié):如窒息早期提高細胞內(nèi)cAMP可使腦血管擴張,改善缺血區(qū)的供血,調(diào)節(jié)腦血管的舒縮功能;促進神經(jīng)元的存活與抗調(diào)亡作用;參與抗炎作用;參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸傳遞過程與學習與記憶過程。MCA是cAMP的新型衍生物,其脂溶性高,易進入細胞;氨茶堿是黃嘌呤類衍生物,是非特異性磷酸二酯酶抑制劑,可延緩cAMP的降解,有助于較長時間維持cAMP水平,達到間接提高細胞內(nèi)cAMP水平的作用。當窒息極期腦血管自主調(diào)節(jié)紊亂,腦血流過渡灌注時,氨茶堿可使血管收縮,減少缺血后反應性充血,防止腦過度灌注,減輕腦水腫。另一方面氨茶堿還有改善通氣功能,強心利尿,抗炎的作用。本實驗結(jié)果提示兩藥合用可有效抑制腦組織內(nèi)氧自由基生成,減輕細胞毒性腦水腫,尤其在改善急性缺氧性腦損傷的病理結(jié)構(gòu)與抑制細胞調(diào)亡方面較單一用藥組效果更好。推測可能與兩藥合用治療急性缺氧性腦損傷具