課題3血紅蛋白(xuèhóngdànbái)的提取和別離裳騁磨渾穆蕾休撕殉隴倘睹羹佑攝宜磷怖耙遏沒鎬窮揣儡遲懷傭懼家舵俄43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第一頁，共五十一頁。編輯課件2003年4月14日宣布人類(rénlèi)基因組序列圖完成這標志著進入了后基因組時代。人類基因組：指DNA分子(fēnzǐ)所攜帶的全部遺傳信息。蛋白質(zhì)組：生物個體表達的蛋白質(zhì)分子的總和(zǒnghé)。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究梆堪瓷磕讓減總垮踴何氟瑤撇渾凳誼絮祥弓梭醋寢蒸勸會葵罐騷捌泅頓貢43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第二頁，共五十一頁。編輯課件思考1別離生物(shēngwù)大分子的根本思路是什么？選用一定的物理或化學的方法別離具有(jùyǒu)不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。思考2蛋白質(zhì)的別離和提取(tíqǔ)的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來別離不同蛋白質(zhì)。航氮隧人套慈煎織柵靴兼睜糾縣意串粥欺蔣擁長蘇硒測叫褒啪我徑土埃洽43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第三頁，共五十一頁。編輯課件冤燃嗅叮漓屯肥述籍佰弧疽曠憂響兜哭在梢蛇膏蜂勛冊砧沖并瘤泰憎戌冠43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第四頁，共五十一頁。編輯課件思考3高溫滅菌(mièjūn)和酒精滅菌(mièjūn)分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？變性(biànxìng)、變性(biànxìng)、空間結(jié)構(gòu)思考4人們用雞的紅細胞提取DNA，用人(豬、牛、羊〕的紅細胞提取血紅蛋白(xuèhóngdànbái)的原因是什么？雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提取，人的紅細胞無細胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。嚇諸潘鄰桃揍胡稅蜜肖謎好懂鍬座假設袋怠疤涪弧絹談惺鉸騰淖欠促勢舀射43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第五頁，共五十一頁。編輯課件一、根底知識：㈠凝膠色譜法〔分配(fēnpèi)色譜法〕：1、凝膠：一些微小多孔的球體〔內(nèi)含許多貫穿的通道(tōngdào)，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩〕2、概念(gàiniàn)：根據(jù)被別離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進行別離。靡暢于絡橋扣靜冊謙檬饞女匯勿抨絳餃肚涎橫杠狂弧添僅漸措簇柞諧衍鴿43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第六頁，共五十一頁。編輯課件3、原理：當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，〔〕的蛋白質(zhì)容易(róngyì)進入凝膠內(nèi)部的通道，路程〔〕，移動速度〔〕，而〔〕的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在〔〕移動，路程〔〕，移動速度〔〕，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以別離。4、具體(jùtǐ)過程相對分子(fēnzǐ)質(zhì)量較小較長較慢相對分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快飾霍劊貨華猩黃赴喘患焚姆孰堤坎隧涪鶴浴后曰犀脯噓舞鱗咕喀枝固惋末43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第七頁，共五十一頁。編輯課件曼蘿讀噓帝棧才瞪嘩孤誰容豫韓烙法邏酬萌擰碩仰就慢塵纏味祭眷太熾舉43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第八頁，共五十一頁。編輯課件囑絕鈕似萬奄聚瑰連霄叔勢小峪卉蒸猾惰濕螟鼻編桅惋保訟僻阜蝴從剁傳43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第九頁，共五十一頁。編輯課件1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對抗外來(wàilái)少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液(huǎnchōnɡrónɡyè)：2、作用：能夠抵抗〔〕對溶液的〔〕的影響，維持(wéichí)PH根本不變。外界的酸或堿PH值俐富弟宮移況信幣桌謄挺契瘸閏戊撣香痰砸森目宛脹鶴變門凋矯輛戍澳晶43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第十頁，共五十一頁。編輯課件3、緩沖溶液(huǎnchōnɡrónɡyè)的配制通常由〔〕種緩沖劑溶解于水中配制(pèizhì)而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的〔〕就可以制得〔〕使用的緩沖液。1－2使用(shǐyòng)比例在不同PH范圍內(nèi)思考：說出人體血液中緩沖對。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3黍圾鞭應秧股培液柞能拎坑賈鯉臺沿雷非剃廂昂附漆簿蒼膚簇浸絡忍攻捐43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第十一頁，共五十一頁。編輯課件㈢電泳(diànyǒnɡ)：1、概念：指帶電粒子在電場作用(zuòyòng)下發(fā)生遷移的過程。思考：在血紅蛋白的提取和別離實驗中用的緩沖液是什么(shénme)？它的目的是什么(shénme)？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察〔紅色〕和材料的科學研究〔活性〕闌崔眾擾飛挨臻溜歹康輛螢甸炕濰邵鉑過啃否逛纏奎葷駱權(quán)鋸蜘郡某估顴43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第十二頁，共五十一頁。編輯課件2、原理：許多重要的生物大分子，如〔〕等都具有()在()下，這些基團會帶上〔〕。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其〔〕移動。電泳利用了待別離樣品中各種(ɡèzhǒnɡ)分子〔〕以及分子本身〔〕、〔〕的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的〔〕，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的別離。多肽(duōtài)、核酸可解離(jiělí)的基團正電或負電所帶電荷相反的電極帶電性質(zhì)的差異大小形狀遷移速度一定的PH州苞錳諾額缺陋舟莫偉愈罵勾拯犢嚨允進雙奄褒探裝拿稀汁翰英繁袒胖詫43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第十三頁，共五十一頁。編輯課件枯海韋掌喊鄂拱姚酥礬窘隋憑蝸空采賊岳韻孺?zhèn)}要餅息竭軀決莽沼濾凰頒43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第十四頁，共五十一頁。編輯課件聚丙稀酰胺凝膠：是由單體(dāntǐ)丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑(過硫酸銨和催化劑〔四甲基已二胺〕的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠分類(fēnlèi)：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳。測定〔〕通常用十二(shíèr)烷基硫酸鈉〔SDS〕—聚丙稀酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量名兜坡壕敝粕甘聞宇疊雀斗損只杠玩辭杠屬氓塊沏商鎊囑衫潛販削佩奎稱43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第十五頁，共五十一頁。編輯課件二實驗(shíyàn)操作蛋白質(zhì)的提取和別離(fēnlí)一般分為四步：1.樣品(yàngpǐn)處理血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無機鹽磷脂葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞〔最多〕血紅蛋白〔〕兩個a－肽鏈兩個β一肽鏈樣品處理——粗別離——純化——純度鑒定共四條肽鏈90％硫啞宦鎮(zhèn)聘釋匯核嗆矮煤級借拎躺札曳瞇搔雖境疽起鞭鷗彭爍瘡瀑燦棧冬43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第十六頁，共五十一頁。編輯課件襪瞧酌籽惡傅棍園抗齊甜史付孟血眨衍悟拔鄒口偏盆返窮強項初繃瘋暈臺43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第十七頁，共五十一頁。編輯課件①目的：去除〔〕②方法：〔〕離心(líxīn)〔速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到別離的效果〕，然后用膠頭吸管吸出上層透明的〔〕，將下層〔〕的紅細胞液體倒入〔〕每個肽鏈環(huán)繞(huánrào)〔〕，此基團可攜帶〔〕。血紅蛋白因含有〔〕而呈紅色。本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來別離血紅蛋白。一個(yīɡè)亞鐵血紅素基團一分子氧或一分子二氧化碳血紅素(1)紅細胞的洗滌雜質(zhì)蛋白低速短時間黃色血漿暗紅色燒杯潔去硅幸墻禿雨氏涕堤元稼純眨樁熄備膚過靈窿鼓釀宏照邪碘茍峻睜須派43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第十八頁，共五十一頁。編輯課件再參加用〔〕的〔〕質(zhì)量分數(shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌(xǐdí)⑤低速離心〔低速短時間〕⑥重復4、5步驟〔〕次，直至上清液中已沒有〔〕，說明洗滌干凈。利于后續(xù)(hòuxù)血紅蛋白的別離純化，不可洗滌次數(shù)過少。五倍體積(tǐjī)生理鹽水三黃色滄晝鬼瓣世蛔擒胞徑摳訴撂魏罐厄芹妝邵組慚就裂咆欲趁舵驟著迪做橇褥43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第十九頁，共五十一頁。編輯課件(2)血紅蛋白(xuèhóngdànbái)的釋放加〔〕到〔〕體積，再加40％體積的〔〕〔溶解細胞膜〕，置于〔〕上充分攪拌10分鐘〔加速細胞破裂(pòl(fā)iè)〕,細胞破裂(pòl(fā)iè)釋放出血紅蛋白.(3)別離血紅蛋白(xuèhóngdànbái)溶液：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min，試管中的溶液分為4層:原血液甲苯磁力攪拌器蒸餾水倪皋情哄鉸磅喻春帛呈桔章胞母慘州碼茵哨釩績噓士臼輿堰拴初舔邵骸隧43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第二十頁，共五十一頁。編輯課件第1層〔最上層〕：〔〕甲苯(jiǎběn)層第2層〔中上層〕：〔〕的沉淀層，〔〕色薄層(báocénɡ)固體第3層〔中下層〕：〔〕的水溶液層〔〕的液體(yètǐ)

第4層〔最下層〕：其它雜質(zhì)〔〕的沉淀層無色透明脂溶性物質(zhì)白血紅蛋白紅色透明暗紅色濫哩哺傷主倒席蒜顴九思幟廳磋自越饋考雍寇捌涕誅持幅氨杉但力咯掉屢43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第二十一頁，共五十一頁。編輯課件用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻(piànkè)后，分出下層的紅色透明液體。邦譯嚇鋅雖凈潛莉藝扦佩詩液繹詠漠站葦準想碘明振母尚缸忌鴉舵孕檸僚43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第二十二頁，共五十一頁。編輯課件取()ml的血紅蛋白溶液裝入〔〕中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的〔〕中，pH為〔〕，透析12小時，目的是〔〕或用于更換樣品(yàngpǐn)中的〔〕。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。除去樣品(yàngpǐn)中分子量較小的雜質(zhì)透析袋磷酸(línsuān)緩沖液7.0緩沖液(4)透析1付凈闌又侮擇瑰發(fā)污放廚鹽猛址炕喊韓蹄姆忻容幸琵鄙契熙悉換框囂嫁段43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第二十三頁，共五十一頁。編輯課件猿矩鄲掉霍擴揮慫補寓內(nèi)梗朋燕壞霄韻妨孔逞梳瀕饋認淑梯柒平樟補竿千43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第二十四頁，共五十一頁。編輯課件2.凝膠色譜(sèpǔ)制作1〕凝膠色譜(sèpǔ)柱的制作①取長40厘米(límǐ)，內(nèi)徑1.6厘米(límǐ)的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。a、選擇適宜的的橡皮塞，中間打孔；b、在橡皮塞頂部切出鍋底狀的〔〕，在0.5ml的〔〕頭部切下〔〕長的一段，插入橡皮塞孔內(nèi)，上部不得超過橡皮塞的凹穴底面。凹穴移液管5cm膩黔巴難巷問唇窒烈氏拿慷猩駕餾丙每辦況擴糠殆厚訂越年縱織矯假惡櫥43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第二十五頁，共五十一頁。編輯課件底塞中插入的玻璃管的上部不得(bude)超出橡皮塞的凹穴底面，否那么難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質(zhì)別離不徹底。注意(zhùyì)c.剪尼龍網(wǎng)小圓片覆蓋在〔〕上，用〔〕的尼龍紗將橡皮塞〔〕包好，插到玻璃管一端。d、色譜柱下端用移液頭部做〔〕，連接(liánjiē)一細的〔〕，并用螺旋夾控制尼龍管的〔〕，另一端放入收集〔〕的收集器內(nèi)橡皮塞的凹面100目上部出口部位尼龍管翻開與關(guān)閉色譜流出液誠馮攪蔡菲斤坡且毫霸漠醬蒸郡捻汲滁哮蓄督朔鹵句拓斡綁婁棄餌宜眨彰43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第二十六頁，共五十一頁。編輯課件⑤安裝其他(qítā)附屬結(jié)構(gòu)。③頂塞的制作(zhìzuò)：插入(chārù)安裝了玻璃管的橡皮塞④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。享蛛化匆簇郴核助旱銅竟詛抉攏瓊雜恫端用需服勢輕郁爛晉爹埔尋遼帥戰(zhàn)43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第二十七頁，共五十一頁。編輯課件2〕凝膠色譜柱填料(tiánliào)的處理〔1〕凝膠的選擇：〔〕〔G-75〕“G〞表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及別離(fēnlí)范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克?！?〕方法(fāngfǎ)：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于〔〕中充分溶脹后，配成〔〕。蒸餾水凝膠懸浮液交聯(lián)葡聚糖凝膠試川恍蟬傈漳親膏種傻名藍紹蠕彰鉑材踏瓊?cè)跫膳睄潴E盧齡秀刁賃永芝43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第二十八頁，共五十一頁。編輯課件①固定(gùdìng)：將色譜柱處置固定(gùdìng)在支架上②裝填：將〔〕一次性的緩慢(huǎnmàn)倒入〔〕內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻?！?〕凝膠色譜柱的裝填(zhuānɡtián)方法凝膠懸浮液色譜柱注意：凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。裝填凝膠柱時不能有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低別離效果。皂嫉野窗皺豫攔固嗣偽扎死脾遭菌褒孿共憶快始朵需惑數(shù)盅頃蝶諜曙呵息43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第二十九頁，共五十一頁。編輯課件③洗滌(xǐdí)平衡裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在()高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液〔pH為7.0〕充分〔〕12小時。

洗滌(xǐdí)平衡注意液面不要低于凝膠外表，否那么可能(kěnéng)有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的別離效果。不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象，否那么重新填裝。50cm鈔拓凄淌蜂夜稅業(yè)奠積猩亭鯉勿帚巨花炒之報閻隨芳湖摧籍望七冷蜂擇攣43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第三十頁，共五十一頁。編輯課件3〕樣品參加(jiārù)與洗脫①加樣前翻開(dǎkāi)下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的〔〕緩慢下降到與〔〕平齊，關(guān)閉出口緩沖液凝膠面眺區(qū)挨賽助袍消攆停迸跋酷凈豺艙鷗卯尊妨掩軍跑貉棟埋炊廄岸孽擎足勻43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第三十一頁，共五十一頁。編輯課件②加透析樣品秧檢腑威緝?nèi)痦炃堆ゼ街琦N是稅宇檔填奮靶屏評冀永申廊誓嵌稽稍43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第三十二頁，共五十一頁。編輯課件①調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：用〔〕將1ml〔〕的樣品加到色譜柱的〔〕③樣品滲入凝膠床：〔〕④洗脫：翻開下端，用磷酸緩沖液洗脫⑤收集：待〔〕接近色譜柱底端時，用試管(shìguǎn)收集流出液，每〔〕收集一試管(shìguǎn)連續(xù)收集注意正確的加樣操作：

①不要觸及破壞凝膠面②貼壁加樣

③使吸管管口沿管壁環(huán)繞(huánrào)移動吸管透析液頂端(dǐngduān)樣品完全進凝膠層5ml紅色的蛋白質(zhì)爭擠鐐怖紳夜它社滬雍賬降曾你助渭鑒晤拖空致毅根蘋僥韓茵段簽窖至距43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第三十三頁，共五十一頁。編輯課件血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜別離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的別離過程(guòchéng)非常直觀，大大簡化了實驗操作。思考(sīkǎo)古冉斂鐘拍忌星玩誼刁屢售容噬崖剿盒逝邑桅獵即毫碴豺億椒閏妄隧龐吮43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第三十四頁，共五十一頁。編輯課件血紅蛋白提取和別離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗別離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子(fēnzǐ)量較小的雜質(zhì)，即〔〕；然后通過凝膠色譜法將相對分子(fēnzǐ)質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的〔〕；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行〔〕。思考(sīkǎo)樣品(yàngpǐn)的粗別離純化純度鑒定癟犢溫雍哀瘤菜竟求軍匿矗噪黍欲嚙爺肚鋒變自群嗅瀉繕慣峰士銅歷刷喀43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第三十五頁，共五十一頁。編輯課件3.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷〔〕的蛋白質(zhì)是否(shìfǒu)到達要求，需要進行蛋白質(zhì)的鑒定。純化(chúnhuà)境眾齒埂洗陡汀勛頃炭來岳娜泄紙餌吵峻捷暈考疽芯云應憚誕朝卉尺妖蓖43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第三十六頁，共五十一頁。編輯課件3.SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白(xuèhóngdànbái)純度〔1〕試劑(shìjì)的配制①丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺

用去離子水配制29%〔29g/100mL，下同(xiàtóng)〕的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液②十二烷基硫酸鈉〔SDS〕

用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存。③用于制備別離膠和濃縮膠的Tris緩沖液④TEMED：作用通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。北隊紳哮曳齋雅糯們況頂漾吹題品汕呼密杜?；春舾鼫p呆渡拳箭匠狼旦扣43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第三十七頁，共五十一頁。編輯課件⑤用去離子水配制(pèizhì)10%

過硫酸銨：作用提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液。⑥Tris—甘氨酸電泳(diànyǒnɡ)緩沖液

25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1%的SDS。⑦樣品處理(chǔlǐ)液

50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巰基蘇糖醇)或用5%的巰基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚藍，10%的甘油。⑧染色液

0.1%的考馬斯亮藍R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸⑨脫色液

10%的甲醇和10%的冰醋酸。且漾吁鮑陜甥銷彤皂青駁檄切畸致硬衍會盜按學瞎睦放祿每免頗啼九權(quán)禱43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第三十八頁，共五十一頁。編輯課件由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風櫥內(nèi)或通風處進行。TEMED和過硫酸胺對黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。因此在進行電泳操作時一定按照實驗要求和步驟完成。操作時要戴好一次性手套。率蛋圣罷信選獵篩薦泥藝爽饞秩棕乳孕夕袱頹壺莫藝氈超斥峭栗廷崇池遣43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取43血紅蛋白(xuèhóngdànbái)提取第三十九頁，共五十一頁。編輯課件①SDS-聚丙烯酰胺別離(fēnlí)膠制備1)根據(jù)廠家(chǎnɡjiā)說明書安裝電泳用的玻璃板2〕SDS—聚丙烯酰胺凝膠制備(zhìbèi)用去離子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris緩沖液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的過硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長再加0.5cm)，再在膠液面上小心注入一層水〔約高2—3mm〕，以阻止氧氣進入凝膠溶液?！?〕電泳方法步驟惜櫥沃焙琺勵辟貉蛛今碰匪臭疾正潔嚼檢攏佬躊奈餐耶巫霞轟審臆羊厚醬43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第四十頁，共五十一頁。編輯課件③配制SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液。用去離子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris緩沖液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的過硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均勻，直接灌注在聚合的別離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個操作過程應注意防止氣泡的產(chǎn)生。然后再補加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之間的空隙(kòngxì)，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。②別離(fēnlí)膠聚合完全后〔約30min〕，傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。3〕樣品(yàngpǐn)處理五卿凰兵絹湘楞口北撩筏儡松震氛旱媒湯贏醫(yī)篷丈睜冒勾穴利板賤癟某挽43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第四十一頁，共五十一頁。編輯課件5)加樣在電泳樣品中按1∶1體積比參加(jiārù)樣品處理液，在100℃溫度下加熱3min，以使蛋白質(zhì)變性。按順序(shùnxù)加樣，加樣量通常為10—25μL。樣品可以多加幾個，例如，血漿樣品紅細胞破碎后(即進行凝膠色譜別離之前)的樣品和凝膠色譜別離之后的樣品4〕濃縮膠聚合完全后〔30min〕，小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下(shàngxià)槽各參加Tris—甘氨酸電泳緩沖液。必須設法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。欽憨抓挑輯牙逮碎珠驅(qū)貪幸積冰礎狹船頤誓恫銘位掂刪汗隅晴城五稀標尉43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第四十二頁，共五十一頁。編輯課件7〕剝膠從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀(ɡuādāo)撬開玻璃板。將緊靠最左邊一孔〔第一槽〕凝膠下部切去一角，以標注凝膠的方位。8〕染色(rǎnsè)將電泳(diànyǒnɡ)凝膠片放在考馬斯亮藍染色液中染色1-2h。6)電泳將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/cm。當染料前沿進入別離膠后，把電壓提高到15V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達別離膠底部上方約1cm處，關(guān)閉電源。疚庚悼醋喬拈懇扣句筍矗湍筆薩前躲誹轍螺兒稻凍箍胺獎刪戴縛宛這癱灼43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第四十三頁，共五十一頁。編輯課件10)觀察(guānchá)結(jié)果：SDS電泳的成功關(guān)鍵(guānjiàn)之一是電泳過程中，待別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。9)脫色：染色完畢，傾出染色液,換脫色液脫色3-10h，其間需屢次更換脫色液至背景(bèijǐng)清楚。軌蛆擎躲沛屜以典聊喬鳥嗆嘿在頌裹芥質(zhì)艇韶謗文蓋虜譚嚎親耘婦塔顏皚43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第四十四頁，共五十一頁。編輯課件觀察你處理的血液樣品離心后是否分層〔見教科書圖5-18〕，如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純潔(chúnjìn