摘要嗜酸乳桿菌作為益生菌的一種，在促進(jìn)人體健康和預(yù)防疾病中具有重要作用，并日益成為乳品科學(xué)研究的熱點(diǎn)。對于嗜酸乳桿菌，不管是活菌制劑的開發(fā)還是嗜酸乳桿菌的分離培養(yǎng)及其酶學(xué)研究、發(fā)酵劑的制備等，都需要良好的增菌培養(yǎng)基，使嗜酸乳桿菌得以大量增殖。因此，優(yōu)化設(shè)計(jì)嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基是一項(xiàng)十分重要的基礎(chǔ)研究工作。本實(shí)驗(yàn)以普通培養(yǎng)基為對照，加入不同的碳源、氮源，以及不同的碳氮源之比，不同的增值因子，對嗜酸乳桿菌進(jìn)行研究，最后還有進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)條件的優(yōu)化選擇，以此來確定最好的增菌培養(yǎng)基。結(jié)果表明：1緒論1.1嗜酸乳桿菌概述嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）屬革蘭氏陽性無芽孢桿菌科的乳桿菌屬，其DNA中G+C含量少于34%~37%mol，形態(tài)呈細(xì)長桿狀，桿的末端呈圓形，以單個(gè)、成對或短鏈形式存在，不運(yùn)動(dòng)，無鞭毛，無芽孢，過氧化氫酶陰性，不產(chǎn)生細(xì)胞色素。不液化明膠，不分解酪素，不產(chǎn)生吲哚和硫化氫。細(xì)胞壁肽聚糖為L-D-天冬氨酸鹽型，通常缺乏磷酸壁，在某些菌株中，可以測出少量甘油磷酸壁，細(xì)胞中不含有任何可以鑒別的己糖和戊糖，是廣泛存在于人體和一些動(dòng)物腸道中的益生菌[1]。近年來，隨著人們健康意識(shí)的逐步增強(qiáng)，益生菌及其制品逐漸成為食品商今后發(fā)展的重點(diǎn)。嗜酸乳桿菌是乳酸菌家族中極為重視研究與開發(fā)的菌種之一，被視為第三代乳酸發(fā)酵劑菌種，嗜酸乳桿菌是人體腸道中的重要微生物，與人體健康息息相關(guān)[2]。當(dāng)其達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，可以起到健康促進(jìn)效果。作為益生制品中常用的主要菌種之一，嗜酸乳桿菌培養(yǎng)的研究極具意義的[3]。1.1.1嗜酸乳桿菌的健康促進(jìn)特性健康促進(jìn)特性是指對人體有益細(xì)菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素、多糖、特殊酶系等，通過改善機(jī)體的微生態(tài)平衡，刺激特異性或非特異性的免疫機(jī)制，達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體健康、防止某些疾病的作用。20世紀(jì)二三十年代，人們用能在人體胃腸道內(nèi)存活的嗜酸乳桿菌制備酸奶并進(jìn)行臨床嘗試，發(fā)現(xiàn)對便秘、痢疾等疾病產(chǎn)生暫時(shí)的緩解作用[4]，嗜酸乳桿菌其健康促進(jìn)特性如下：(1)生物屏障作用[5]嗜酸乳桿菌與腸粘膜上皮細(xì)胞相互作用、密切結(jié)合，構(gòu)成了生物屏障；同時(shí)，通過其自身及其代謝物與其它細(xì)菌之間的相互作用，調(diào)整菌群之間的關(guān)系，維持和保證菌群最佳優(yōu)勢組合以及組合的穩(wěn)定，阻止了致病菌的定殖和入侵，拮抗致病菌和有害微生物的生長及其毒素的粘附引[6]。(2)營養(yǎng)作用[7]乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)生的乳酸，可提高胃內(nèi)食物的預(yù)消化，提高鈣、磷、鐵的利用率和維生素D的吸收。乳糖分解產(chǎn)生的半乳糖，是構(gòu)成腦神經(jīng)系統(tǒng)中腦苷脂的成分，與嬰幼兒出生后的生長有密切的關(guān)系；產(chǎn)生的大量維生素B群能促進(jìn)人體神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育；提高人體腸內(nèi)的β一半乳糖苷酶的活性，促進(jìn)奶質(zhì)中乳糖的吸收，從而緩解乳糖不耐癥。能分泌蛋白酶，促進(jìn)蛋白質(zhì)的消化吸收。(3)抗癌作用[8]流行病學(xué)研究表明，腐敗性細(xì)菌作用于食物成分和膽汁酸鹽類，能生成亞硝基化合物、膽固醇及膽汁酸的代謝物、氨基酸代謝物(酚類、吲哚、硫化氫)等有機(jī)致癌物質(zhì)。與這些致癌物質(zhì)有關(guān)的腸內(nèi)細(xì)菌酶有β一葡萄糖醛酸酶、巰基還原酶、偶氮還原酶等。嗜酸乳桿菌能改善腸道菌群，抑制了致癌物質(zhì)的產(chǎn)生[9]；同時(shí)，嗜酸乳桿菌及其代謝物活化了免疫功能，抑制癌細(xì)胞的形成和增殖[10-12]。(4)降低膽固醇水平普遍認(rèn)為，高膽固醇癥是引起心臟發(fā)病的主要原因之一，因此降低膽固醇水平意味著減少心臟病發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)，Gilliland[13-14]等、Lin[15]等、Thompson[16]等對嗜酸乳桿菌降低膽固醇的能力作了研究，他們指出，在厭氧和膽汁鹽存在的情況下，嗜酸乳桿菌能夠明顯的降低培養(yǎng)介質(zhì)中膽固醇的含量。有關(guān)乳酸菌降低膽固醇的機(jī)理尚不清楚。目前存在兩種看法：一種看法認(rèn)為，乳酸菌擁有能夠修飾膽固醇的酶系，膽固醇能夠被細(xì)菌細(xì)胞同化；另一種認(rèn)為，某些乳酸菌種具有使?；悄懰岷透拾钡醿煞N膽汁酸脫結(jié)合的能力，結(jié)合后的膽汁酸影響腸道內(nèi)脂類物質(zhì)的吸收，進(jìn)而導(dǎo)致膽固醇的吸收能力降低。影響膽固醇的水平。(5)延緩衰老效應(yīng)人的衰老與腸內(nèi)有害細(xì)菌產(chǎn)生的氨、胺、硫化氫、吲哚、酚、糞臭素等有害腐敗產(chǎn)物有很大關(guān)系。嗜酸乳桿菌代謝產(chǎn)生的乳酸能夠抑制這些腐敗物，使機(jī)體衰老的過程變得緩慢。1.1.2(1)在乳品中的應(yīng)用乳是乳酸菌良好的天然培養(yǎng)基，含有能促進(jìn)人類生長發(fā)育及維持健康水平的幾乎一切的必須營養(yǎng)成分，被認(rèn)為是迄今為止一種比較理想的完全食品。乳中含有4．6％一4．9％乳糖[17]，是乳酸菌代謝中重要的碳水化合物來源。因此乳酸菌的應(yīng)用首先體現(xiàn)在乳制品上。公元前641年就有“酸奶"的記載，諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主梅其尼科夫在20世紀(jì)初就提出“酸奶長壽說”。嗜酸乳桿菌在乳品中應(yīng)用最多的是發(fā)酵乳產(chǎn)品。用于傳統(tǒng)酸奶的發(fā)酵菌種主要是保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌。普通酸奶生產(chǎn)所用的發(fā)酵菌種為前兩種。前兩種菌具有優(yōu)良的發(fā)酵性能并能賦予酸奶良好的風(fēng)味，但是耐受胃酸和膽汁酸的性能差，其存活率0．01％'-'0．65％，也不能在腸道內(nèi)定殖，所以有益作用受到很大限制。嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸和產(chǎn)黏能力強(qiáng)，但是風(fēng)味差。與前兩種菌結(jié)合使用，既能獲得良好風(fēng)味，又能發(fā)揮其生理功能使發(fā)酵乳具有很好的益生作用。Sander[18](1994)報(bào)道，在法國，含有雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的新型乳制品占整個(gè)乳消費(fèi)量的的4％，在瑞典則占25％，而且在產(chǎn)品名稱前加“bio”即“生物性”。Sandine報(bào)道，利用超濾乳制得類似于普通乳制品中，含有108個(gè)／ml活性嗜酸乳桿菌。Nilson[19]等報(bào)道，在印度，嗜酸乳桿菌已應(yīng)用于冰激凌中，這種產(chǎn)品是將嗜酸乳桿菌的細(xì)胞制劑加入到冰激凌中，制成可口、具有療效的冰凍產(chǎn)品。目前，嗜酸乳桿菌已經(jīng)用于酸奶、奶酪、酸奶油、馬奶酒等常見的發(fā)酵乳制品。基于人們的健康需求看乳品市場前景，嗜酸乳桿菌是理想的第三代發(fā)酵劑。(2)在醫(yī)藥上的應(yīng)用嗜酸乳桿菌在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用主要是由于其所具有的保健作用。自20世紀(jì)50年代以來，抗生素得到了廣泛的應(yīng)用，然而給人們帶來的危害也越來越多，長期使用抗生素會(huì)導(dǎo)致腸道菌群紊亂，造成腸道功能失調(diào)和耐藥菌株增加[19]，因此，人們試圖求助于生物防治療法。國外嗜酸乳桿菌制劑的研究較為普及，產(chǎn)品種類繁多。德國的Malutka，法國的Synerlac等適用于不同生理，病理人群，具有明顯的醫(yī)療效果。我國對嗜酸乳桿菌的研究應(yīng)用相對較少，如能采用現(xiàn)代的生物技術(shù)篩選出具有優(yōu)良性能的菌株，開發(fā)出具有明顯療效的作用的產(chǎn)品，必將受到消費(fèi)者的青睞，獲得良好的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。(3)在工業(yè)上的應(yīng)用目前嗜酸乳桿菌在工業(yè)上的應(yīng)用主要是生產(chǎn)乳酸。乳酸是具有重要的工業(yè)價(jià)值的有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工紡織業(yè)、電鍍等。目前全世界乳酸的產(chǎn)量為30kt。我國在1994年于重慶率先生產(chǎn)藥用乳酸鈣。隨著技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外對乳酸菌的發(fā)酵、回收和精致等一系列技術(shù)進(jìn)行了很多研究，以便為嗜酸乳桿菌產(chǎn)乳酸的發(fā)展找到一條更為便捷、經(jīng)濟(jì)的方法[20]。1.2嗜酸乳桿菌研究開發(fā)建議[21]1.2益生菌市場的核心問題是菌種的選擇和菌種的活性。開發(fā)新菌種、培育優(yōu)良菌種，是該領(lǐng)域前沿性的、獨(dú)占性利益的研究。前端時(shí)間伊利集團(tuán)購買了芬蘭維利奧公司益生菌LGG的五年使用權(quán)，就是菌種資源價(jià)值的實(shí)際例證。我國地域遼闊，氣候多樣，菌種豐富。如內(nèi)蒙古地區(qū)東西跨度大，草原類型齊全，利用自然有益菌的歷史悠久，所以乳酸菌種類非常豐富。近年，有日本學(xué)者來內(nèi)蒙古、甘肅等地采集馬奶酒等產(chǎn)品的菌種，對我國應(yīng)該有所啟示。我國政府應(yīng)該從物種唯一性的戰(zhàn)略高度，采取保護(hù)呵呵開發(fā)對策。有的傳統(tǒng)特色產(chǎn)品中含有獨(dú)特菌種和菌株，可能具有特殊的生理功能，是開發(fā)特色產(chǎn)品的重要資源。另外，開發(fā)與保護(hù)稀有菌種，也是生物保護(hù)的重大問題。1.2研究表明，同一菌種的不同菌株，生理功效存在較大差異，實(shí)際應(yīng)用中依賴相近菌株推測后直接使用，必須對菌株和產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格檢驗(yàn)鑒定后方可使用。1.2嗜酸乳桿菌的商品化在技術(shù)層面涉及生理特性、生物學(xué)特性、功能與效用，其相關(guān)因素有生長促進(jìn)劑、抑菌劑、螯合劑、防凍劑和菌種保護(hù)劑等。目前，我國對這些要素的研究與運(yùn)用還處于探索與改善階段，應(yīng)該從商品化角度對潛力大的菌株進(jìn)行重點(diǎn)系統(tǒng)研究，如嗜酸乳桿菌生長緩慢，如果予以適當(dāng)?shù)纳L促進(jìn)劑，就可以降低產(chǎn)品成本。應(yīng)該加快商品化的研究。1.2傳統(tǒng)的嗜酸乳桿菌劑型都是液態(tài)，目前研究重點(diǎn)幾種在凍干型劑型上。已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)踐的凍干型劑型其優(yōu)點(diǎn)是活菌含量高，保存和管理簡單，保藏期長，接種方便，不含有酵母、霉菌等雜質(zhì)。缺點(diǎn)是儲(chǔ)存條件要求高，無論液態(tài)還是凍干型，都有明顯不足。故低成本、方便儲(chǔ)存和使用的劑型仍然是今后的主要研究內(nèi)容。1.2這是直接關(guān)系功能與應(yīng)用的研究。目前，嗜酸乳桿菌在體內(nèi)的競爭排斥機(jī)理及其影響因素還沒有完全清楚，某些預(yù)防疾病的機(jī)理需要進(jìn)一步明確。例如，膽固醇同化吸收機(jī)理，在菌體死亡后可能被重新釋放出，對機(jī)體的影響是什么？嗜酸乳桿菌可能會(huì)產(chǎn)生過敏，機(jī)理與誘發(fā)條件是什么[22]？嗜酸乳桿菌是種重要的益生菌，應(yīng)該加快嗜酸乳桿菌作為保健食品的商品化進(jìn)程，應(yīng)該明確對特殊人群的排除，如免疫功能障礙的人（如AIDS感染者）是否可以使用尚待研究。應(yīng)該加快飼料方面的實(shí)用化研究，用于臨床的醫(yī)藥品還需進(jìn)一步探明作用機(jī)理，進(jìn)而通過臨床驗(yàn)證方可考慮實(shí)際應(yīng)用。1.3嗜酸乳桿菌未來研究方向未來的嗜酸乳桿活菌制劑的發(fā)展必然是基礎(chǔ)研究與應(yīng)用相結(jié)合，高技術(shù)篩選和培育新菌種與嗜酸乳桿菌生長因子的開發(fā)相結(jié)合，并考慮技術(shù)的工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。隨著技術(shù)的進(jìn)步和人們對嗜酸乳桿菌生理功能的認(rèn)識(shí)，嗜酸乳桿菌益生菌必然會(huì)為人類的健康發(fā)揮越來越大的作用。當(dāng)前及今后的一段時(shí)間中，益生菌的研究將主要集中在：篩選更具優(yōu)良性能的益生菌菌株，全面了解某一菌株的生理特性，從不同的角度進(jìn)行評價(jià)，并進(jìn)行動(dòng)物模型和人體臨床實(shí)驗(yàn)的功能驗(yàn)證。進(jìn)一步加強(qiáng)對益生菌作用機(jī)理的研究，以指導(dǎo)益生菌制品的研制、生產(chǎn)及使用。加強(qiáng)對益生菌劑型的研究，增加益生菌菌株的穩(wěn)定性。主要是提高活菌的濃度和活菌對不良環(huán)境的耐受力、延長產(chǎn)品的保存期，這是目前益生菌研究的一個(gè)難點(diǎn)。作為益生菌的菌株，必須具有很高的穩(wěn)定性，包括耐酸和耐膽鹽性等。為使投放的益生菌發(fā)揮預(yù)期的效力，投放菌必須以較高的活菌數(shù)通過胃到達(dá)腸道并定居在腸道內(nèi)增值。然而，即使所投給的益生菌是腸道的固有菌，也很難通過胃部的極端環(huán)境而在腸道內(nèi)定居。這是影響益生菌效果的重要原因之一。因此，應(yīng)開發(fā)多種劑型如粉劑、片劑（胃溶劑和腸溶劑）、顆粒劑及微膠囊劑等，以確保益生菌能順利通過腸胃道而發(fā)揮其益生菌作用。開發(fā)與各種益生菌因子配合的產(chǎn)品。如寡糖可作為雙歧桿菌的促生長因子，但不容易被吸收、熱量低，可將寡糖添加到食品中。在分子生物學(xué)水平上初步研究不同生理功能的菌株質(zhì)檢的差異，深入了解益生菌的作用機(jī)制，為采用基因工程技術(shù)改造或構(gòu)建新菌種、培育優(yōu)良菌株和開發(fā)新的益生菌產(chǎn)品奠定理論基礎(chǔ)。1.4存在的問題和本研究的目的和意義.1嗜酸乳桿菌益生菌因其廣泛而重要的生理功能在保健食品和飼料的開發(fā)中具有遠(yuǎn)大的發(fā)展前景，在替代抗生素方面也帶來了希望。但是，目前益生菌作用效果、穩(wěn)定性、有效性均有待于提高。國內(nèi)于20世紀(jì)80年代初開始了活菌制劑方面的研究工作，但目前國內(nèi)市場上的微生態(tài)制劑仍然存在著許多問題，如菌種的真?zhèn)?、活菌的?shù)量、產(chǎn)物有效成分和耐藥因子的有無等。1.4.1隨著研究的深入，乳酸菌細(xì)菌素的應(yīng)用前景越來越受到人們的廣泛關(guān)注，然而在細(xì)菌素的研究中仍存在許多有待解決的問題，主要體現(xiàn)在：細(xì)菌素的產(chǎn)量普遍較低，目前的研究方向主要集中在篩選高產(chǎn)菌株及構(gòu)建工程菌株上；細(xì)菌素的抑菌譜普遍較窄，目前報(bào)道的細(xì)菌素一般只對革蘭氏陽性菌有抑制作用，而對革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌沒有作用，而且不同種屬的抑菌機(jī)制尚不十分清楚；細(xì)菌素在不同食品介質(zhì)中的溶解性和穩(wěn)定性較差，限制了它們的廣泛應(yīng)用；評價(jià)其應(yīng)用潛力的工作仍然是以一般性報(bào)道為主，尚有待更深入的研究；因此，在今后的一段時(shí)間中，乳酸菌細(xì)菌素的研究重點(diǎn)可能會(huì)集中在以下幾方面：根據(jù)已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)全新的氨基酸序列，人工合成新型細(xì)菌素或?qū)ΜF(xiàn)有的細(xì)菌素進(jìn)行改造，提高乳酸菌細(xì)菌素的應(yīng)用潛力；通過修飾編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，利用DNA重組技術(shù)產(chǎn)生滿足人們要求的活性多肽或蛋白質(zhì)；提高細(xì)菌素產(chǎn)量水平；拓寬細(xì)菌素抑菌譜，改進(jìn)細(xì)菌素溶解性及在靶位系中的擴(kuò)散性，提高細(xì)菌素穩(wěn)定性；提高細(xì)菌素抑菌比活力；對細(xì)菌素產(chǎn)生菌株的自身免疫性機(jī)制進(jìn)行深入研究。1.4.1在未來嗜酸乳桿菌和其他益生菌一樣存在安全性問題，在評估時(shí)必須考慮以下的因素：致病性、侵染性、毒力因子（包括毒性）、代謝活力及益生菌的生物學(xué)特征等。Donohue和Salmine等認(rèn)為可采用體外試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)等方法來評估益生菌的安全性，根據(jù)這幾項(xiàng)指標(biāo)，少數(shù)目前應(yīng)用的益生菌能滿足安全性標(biāo)準(zhǔn)。Marteau則建議研究益生菌的本質(zhì)特征、藥代動(dòng)力學(xué)、與宿主的相互作用等，作為評估其安全性的依據(jù)[23]。1.4.1不存在致病性和感染性是益生菌安全性的前提之一。最近幾年，長期被認(rèn)為不具有感染性的這些乳酸菌和雙歧桿菌，不斷從臨床感染病例被分離到，引發(fā)了對其安全性及其是否具有感染性的爭議。然而，它們不太可能具有廣泛的感染性，這些臨床分離到的菌株更像是一些偶然性感染的結(jié)果。盡管乳酸菌和雙歧桿菌可通過轉(zhuǎn)位或其他方式侵入宿主機(jī)體，因其菌血癥。但是，內(nèi)心肌炎或其他感染到敗血癥的系統(tǒng)性感染的感染過程需要細(xì)菌和宿主雙方因素的共同參與。然而，要評估這種相互作用濤困難了。因此，在評估益生菌的安全性時(shí)，考慮如下的問題可能更切實(shí)可行，即考慮對宿主的入侵是否引發(fā)嚴(yán)重后果以及入侵后對宿主產(chǎn)生的作用等。益生菌是否具有感染性危害難以證明，尤其是厭氧菌，通常認(rèn)為它們不具有感染性，盡管采取口服方式，這些細(xì)菌通常不會(huì)引起健康動(dòng)物感染。對于那些具有輕微感染性的益生菌細(xì)菌，這一點(diǎn)尤為明顯。即使那些具有強(qiáng)感染性的細(xì)菌，如果采用單一的種也不容易使動(dòng)物發(fā)生感染，需要采用多種技術(shù)（方法）。例如，對試驗(yàn)體系采取各種預(yù)處理或使用混合感染的方式，才能使感染建立。通過急性及慢性毒性試驗(yàn)可獲得某種細(xì)菌毒性的資料。例如，對B.longumBB536而言，其對小鼠的急性（單次口服）半數(shù)致死量（LD50）大于50g/kg（或5×1013cfu/kg）；而口服的話，即使按2.5×1011cfu/(kg.d)的方式持續(xù)口服一年，也不表現(xiàn)出毒性。1.4.1對益生菌的另一眼球是在其代謝過程中不能產(chǎn)生有害的物質(zhì)。方法之一是檢測這些是否會(huì)將食物成分或宿主的分泌物轉(zhuǎn)化成不利于宿主的次級有害物。例如，某些腸道細(xì)菌在分解食物蛋白時(shí)會(huì)產(chǎn)生NH3、吲哚、酚及胺等有害物質(zhì)；盡管尚無有關(guān)雙歧桿菌或乳酸菌產(chǎn)生毒性極強(qiáng)化合物的報(bào)道，但能產(chǎn)生和利用NH3仍然引起人們的關(guān)注。Hraya-Kojima等測定了人源雙歧桿菌中與氨的產(chǎn)生和利用有關(guān)的酶的活性，與其他的腸道菌群相比，雙歧桿菌分解氨基酸產(chǎn)生氨的脫氨酶活性較弱，但同化NH3的能力較強(qiáng)；二次膽鹽是腸道菌群產(chǎn)生的另一類重要的有害物質(zhì)，它們能作用于黏液分泌細(xì)胞，促進(jìn)其增值，因而具有致癌性或者是一種致癌促進(jìn)劑。許多腸道菌群，包括雙歧桿菌和乳桿菌，能分解結(jié)合膽酸鹽，然而，對多種雙歧桿菌（10種），乳酸菌（5種）、Leuconstoclactissubsp.Lactis及S.thermophilus研究后發(fā)現(xiàn)，它們?nèi)狈γ摪泵富富钚裕笳哒c二次膽鹽的產(chǎn)生有關(guān)。對于腸球菌而言，已發(fā)現(xiàn)它們能產(chǎn)生多種裂解細(xì)胞物質(zhì)及其他毒性因子[24]。1.4.1在考慮益生菌安全性時(shí)，對血小板的凝聚活力是必須檢測的項(xiàng)目之一，由細(xì)菌引起的血小板凝聚被認(rèn)為是引發(fā)感染性內(nèi)心肌炎的主要原因。Harry等測定了從感染性內(nèi)心肌炎樣本分離的Lb.rhamnosus和Lb.paracaseisubsp.Paracasei（可能歸入Lb.casei）及其實(shí)驗(yàn)室保存菌株、Lb.acidophlilus、Lb.fermntum、Lb.oris、Lb.plantarum和Lb.salivarius的血小板凝聚活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的菌株之間對血小板凝聚活性差異非常大。實(shí)驗(yàn)室保存的16株Lb.rhamnosus中的8株以及所有從臨床感染性內(nèi)心肌炎樣本分離到的5株Lb.rhamnosus都具有血小板凝聚活性，這種凝聚作用與其細(xì)胞表面存在的某些蛋白質(zhì)有關(guān)。此外，還測定了這種細(xì)胞表面成分的憎水性、吸附羥基磷石灰及唾液凝聚性。與實(shí)驗(yàn)室保存菌株相比，從臨床感染性內(nèi)心肌炎分離的Lb.rhamnosus菌株的凝聚活性更高。另外，測定了L.paracaseisubsp.Paracasei及其他菌株可能產(chǎn)生的其他毒性因子，如糖苷酶活性及蛋白酶活性（胺化酶），這兩種酶分別降解人體內(nèi)的糖蛋白和阻礙人體內(nèi)凝血纖維素原的合成并引起其溶解。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分菌株可產(chǎn)生這些酶，表明它們具有潛在的侵染性，可能引起內(nèi)心肌炎。1.4.1Ruseler等對多株乳桿菌及雙歧桿菌降解腸道黏膜糖蛋白的酶的活力進(jìn)行了測定，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)這些菌株具有此類活性。不過在研究益生菌安全性時(shí)，仍需要更深入地研究前面所提及的細(xì)胞表面成分及酶的作用。無論是這種主要由表面蛋白、糖蛋白和凝聚素組成的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)是否與其感染性有關(guān)，還是前面所提及的糖苷酶、蛋白酶活性（胺化酶）及其他能降解人腸道黏膜的酶是否與其感染性有關(guān)，仍有待進(jìn)一步闡明。如果這種聯(lián)系被證明確實(shí)存在，那么目前被認(rèn)為是益生菌必要特征的對人腸道細(xì)胞的粘附性，就需要慎重考慮了。1.4.1抗藥性乳酸菌已不斷被分離到并引起廣泛關(guān)注，尤其是對于腸球菌，許多腸球菌菌株，包括那些從感染部位分離的菌株，已被證明具有多重抗藥性。這種抗藥性可能是通過與藥物的接觸產(chǎn)生，也可能通過被其他抗藥菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。已報(bào)道雙歧桿菌和乳酸菌可通過與藥物的接觸產(chǎn)生抗藥性。為了防止向體內(nèi)土著菌群傳遞或轉(zhuǎn)移其抗藥性，除某些特定目的外，所使用的益生菌原則上不應(yīng)攜帶超出自然獲得的抗藥譜以外的抗藥性。1.4.2本研究以普通培養(yǎng)基為對照，對嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基碳源，氮源，緩沖鹽，微量元素，增值因子各組成成分的優(yōu)化，以及靜態(tài)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，最后確定最優(yōu)培養(yǎng)基的組成成分，以此培養(yǎng)基來進(jìn)行生長動(dòng)力學(xué)的研究，為增加保健食品活菌數(shù)，以此來提高國民生活質(zhì)量提供一個(gè)可靠的參考依據(jù)。2材料與方法2.1材料試劑與儀器設(shè)備2.1.1原料和試劑發(fā)酵菌種：嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）。（由廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系微生物實(shí)驗(yàn)室提供）表2-1實(shí)驗(yàn)主要試劑試劑名稱規(guī)格生產(chǎn)廠商瓊脂粉大豆蛋白胨細(xì)菌學(xué)蛋白胨酵母浸膏牛肉浸膏葡萄糖磷酸氫二鉀鹽酸蔗糖氯化鈉檸檬酸三銨三水合乙酸鈉酒精硫酸錳硫酸鎂蛋白胨，魚粉D-果糖乳糖吐溫-80營養(yǎng)瓊脂麥芽糖鄰苯二甲酸氫鉀月示蛋白胨胰蛋白胨酪氨酸氫氧化鈉酪蛋白胨L-谷氨酸,L-GlutamicaicdD-泛酸鈣鹽酸硫胺維生素B1核黃素維生素B2低聚果糖蛋氨酸分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純廣東環(huán)凱微生物科技有限公司廣東環(huán)凱微生物科技有限公司廣東環(huán)凱微生物科技有限公司廣東環(huán)凱微生物科技有限公司廣東環(huán)凱微生物科技有限公司天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司廣東汕頭市西隴化工廠廣東汕頭市西隴化工廠廣東汕頭市西隴化工廠廣東汕頭市西隴化工廠廣東臺(tái)山粵僑試劑塑料有限公司廣東臺(tái)山粵僑試劑塑料有限公司廣東臺(tái)山粵僑試劑塑料有限公司國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司上海試劑二廠廣東環(huán)凱微生物科技有限公司廣東汕頭市西隴化工廠上海潤捷化學(xué)試劑有限公司山東隆大生物工程有限公司上海康潤生物科技有限公司上?？禎櫳锟萍加邢薰旧ど锕こ蹋ㄉ虾＃┯邢薰緩V東化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心上海源吐生物科技有限公司天津市博迪化工有限公司天津市博迪化工有限公司成都科龍化工試劑廠成都科龍化工試劑廠2.1.2實(shí)驗(yàn)主要儀器表2-2實(shí)驗(yàn)主要儀器、設(shè)備設(shè)備名稱型號生產(chǎn)廠商水浴恒溫箱電子天平電子分析天平光柵分光光度計(jì)雙目生物顯微鏡實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)垂直流超凈工作臺(tái)干燥箱生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)振蕩器電冰箱立式壓力蒸汽消毒器數(shù)碼顯微鏡ZHWY—110XT—200AB104—N722E220LEDPHS—25ZHJH-1112C101—3型ZSP1270ZHWH—2112C13C—127TW銀州牌628B—2型DM85上海智城分析儀器制造有限公司美國雙杰兄弟（集團(tuán)）有限公司Mettier—ToledoGroup上海精密科學(xué)儀器有限公司麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司上海理達(dá)儀器廠上海智城分析儀器制造有限公司中華人民共和國上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠上海智城分析儀器制造有限公司上海智城分析儀器制造有限公司柳州市鴻沛電器有限公司鐵嶺市醫(yī)療器械總廠克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司京君龍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司試管規(guī)格：15X15018X18017X180小試管移液管1ml、2ml、5ml、10ml移液槍1ml、5ml載玻片、剪刀、鼻塞比色管、燒杯、玻璃棒、標(biāo)簽、三角瓶、培養(yǎng)皿ＰＨ試紙。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1發(fā)酵菌種的活化[25]（1）MRS培養(yǎng)基配制：大豆蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、吐溫801g、磷酸氫二鉀2g、乙酸鈉5g、檸檬三銨2g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.54g，加蒸餾水至1000mL，1NHCl調(diào)PH為6.2-6.4，121℃15分鐘滅菌。（2）活化方法：將斜面保藏菌種接種于10mL10％的脫脂乳試管中進(jìn)行三次活化，然后按體積比2％的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，以適應(yīng)菌株在培養(yǎng)基中生長，活化好的菌株放于4℃冰箱中，備用。每次測定前，各菌株均在MRS液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接兩次，以便菌株活力得到恢復(fù)。2.2.2培養(yǎng)基碳、氮源的優(yōu)化為確定嗜酸乳桿菌最高活菌數(shù)時(shí)間，以便下面實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，配制普通MRS培養(yǎng)基1000ml，1NHCl調(diào)PH為6.2-6.4，用100ml量筒分裝到250ml的三角錐形瓶當(dāng)中，包扎好進(jìn)行高溫滅菌（121℃20分鐘滅菌），將制備好的培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)24h，若無菌生長，即為合格。取1瓶培養(yǎng)基出來，在垂直流超凈工作臺(tái)按4%的接種量接種，分裝到密封小試管當(dāng)中，每管分裝5ml，放到37℃恒溫箱培養(yǎng)，計(jì)時(shí)培養(yǎng)，每隔兩小時(shí)測定一次吸光度。在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上采用各種不同的碳源和氮源分別取代MRS中的碳源和氮源（用量分別為2%）配制培養(yǎng)基，接種菌種發(fā)酵，根據(jù)菌體生長情況（以菌體密度為指標(biāo)，下同）判斷碳源和氮源的優(yōu)劣。優(yōu)選的碳源或氮源之間的復(fù)合效果采用復(fù)合配比實(shí)驗(yàn)確定最佳復(fù)合氮源或氮源?？蛇x的碳源有：海藻糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、果糖、乳糖、低聚果糖。可選的氮源有：2.2.3培養(yǎng)基不同碳氮源之間搭配固定鹽溶液的量，對選出的碳源及氮源進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定最優(yōu)碳氮源之比。由前面優(yōu)化的碳源及氮源結(jié)果來看，碳源選出三種，分別為乳糖，葡萄糖和果糖，氮源也選出三種，分別是大豆蛋白胨代替牛肉膏，胰蛋白胨代替藥理學(xué)蛋白胨和大豆蛋白胨代替藥理學(xué)蛋白胨，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：2.2.4在普通培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加不同的生長因子(包括多種氨基酸和維生素等)，接種發(fā)酵，根據(jù)菌體生長情況，確定微量元素及生長因子的作用。添加的生長因子分別為維生素B1，維生素B5，谷氨酸，以及蛋氨酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2-62.2.5培養(yǎng)基在試管瓶中，普通培養(yǎng)基為研究基礎(chǔ)一設(shè)置不同溫度、接種量，以O(shè)D為指標(biāo)反映菌體增殖情況，并選出優(yōu)化條件。將100ml的MRS液體培養(yǎng)基中接人4．0％的菌液，分別于35、37、39℃下恒溫培養(yǎng)，以O(shè)D值為指標(biāo)反映菌體增值情況，并選出優(yōu)化條件。按2、4、6％接種量接活化菌液，39℃下靜置培養(yǎng)，測定OD值。2.2.6菌液吸光值（OD600用721#分光光度計(jì)在600nm條件下比色，測定菌液的吸光值。2.2.7用PHS—25型精密pH計(jì)在室溫下測定pH值。操作步驟開機(jī)前的準(zhǔn)備將電極梗旋入電極梗固定座中；將電極夾插入電極梗中；將pH復(fù)合電極安裝在電極夾上；將E-201-C型pH復(fù)合電極下端的電極保護(hù)套套拔下，并且拉下電極上端的橡皮套使其露出上端小孔；e)用蒸餾水清洗電極。儀器使用前首先要標(biāo)定。一般情況下儀器在連續(xù)使用時(shí),每天要標(biāo)定一次。a)將測量電極插座處拔掉Q9短路插頭；b)在測量電極插座處插入復(fù)合電極；c)打開電源開關(guān)，儀器進(jìn)入pH測量狀態(tài)；d)按“溫度”鍵，使儀器進(jìn)入溶液溫度調(diào)節(jié)狀態(tài)（此時(shí)溫度單位℃指示），按“△”鍵或“▽”鍵調(diào)節(jié)溫度顯示數(shù)值上升或下降，使溫度顯示值和溶液溫度一致，然后按“確認(rèn)”鍵，儀器確認(rèn)溶液溫度值后回到pH測量狀態(tài)(溫度設(shè)置鍵在mV測量狀態(tài)下不起作用)；e)按“標(biāo)定”鍵，此時(shí)顯示“標(biāo)定1”“4.00”及“mV”，把用蒸餾水或去離子水清洗過的電極插入pH＝4.00的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液中，儀器顯示實(shí)測的mV值，待mV讀數(shù)穩(wěn)定后按“確認(rèn)”鍵，儀器顯示“標(biāo)定2”“9.18”及“mV”，把用蒸餾水或去離子水清洗過的電極插入pH＝9.18的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液中，儀器顯示實(shí)測的mV值，待mV讀數(shù)穩(wěn)定后按“確認(rèn)”鍵,標(biāo)定結(jié)束，儀器顯示注：儀器在標(biāo)定狀態(tài)下，可通過按“△”鍵選擇三種標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液中的任意二種（pH=4.00、pH=6.86、pH=9.18）作為標(biāo)定液（選定的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液會(huì)在溫度顯示位置顯示出來）標(biāo)定方法同上，第一種溶液標(biāo)定好后仍須按“△”鍵選定第二種標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液。f）用蒸餾水及被測溶液清洗電極后即可對被測溶液進(jìn)行測量。一般情況下，在24h內(nèi)儀器不需再標(biāo)定。經(jīng)標(biāo)定過的儀器，即可用來測量被測溶液，根據(jù)被測溶液與標(biāo)定溶液溫度是否相同，其測量步驟也有所不同。具體操作步驟如下：(l)被測溶液與標(biāo)定溶液溫度相同時(shí)，測量步聚如下：a)用蒸餾水清洗電極頭部，再用被測溶液清洗一次：b)把電極浸入被測溶液中，用玻璃棒攪拌溶液，使其均勻，在顯示屏上讀出溶液的pH值。(2)被測溶液和標(biāo)定溶液溫度不同時(shí)，測量步驟如下：a)用蒸餾水清洗電極頭部，再用被測溶液清洗一次；b)用溫度計(jì)測出被測溶液的溫度值；c)按“溫度”鍵，使儀器進(jìn)入溶液溫度設(shè)置狀態(tài)（此時(shí)“℃”溫度單位指示），按“△”鍵或“▽”鍵調(diào)節(jié)溫度顯示數(shù)值上升或下降，使溫度顯示值和被測溶液溫度值一致，然后按“確認(rèn)”鍵，儀器確定溶液溫度后回到pH測量狀態(tài)。d)把電極插入被測溶液內(nèi)，用玻璃棒攪拌溶液，使其均勻后讀出該溶液的pH值。1．pH4.00溶液：用GR鄰苯二甲酸氫鉀10.12g，溶解于1000ml的高純?nèi)ルx子水中。2．pH6.86溶液：用GR磷酸二氫鉀3.387g、GR磷酸氫二鈉3.533g，溶解于1000mL的高純?nèi)ルx子水中。pH9.18溶液：用GR硼砂3.80g、溶解于1000mL注意：配制2、3溶液所用的水，應(yīng)預(yù)先煮沸（15~30）min，除去溶解的二氧化碳。在冷卻過程中應(yīng)避免與空氣接觸，以防止二氧化碳的污染。2.2.8菌液滴定酸度（°NaOH滴定法，按GB5409-89方法測定。（1）NaOH溶液的標(biāo)定

準(zhǔn)確稱取基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀0.4-0.5g之間的質(zhì)量→用大約25ml水溶解于錐形瓶內(nèi)→加2滴酚酞指示劑（無色）→用配置好的NaOH溶液滴定鄰苯二甲酸氫鉀溶液→粉紅色30s不褪停止滴定→記錄所用NaOH溶液的體積（滴定時(shí)右手搖動(dòng)錐形瓶，左手控制堿式滴定管，邊滴邊觀察滴定管的刻度防止NaOH溶液用盡。平行標(biāo)定2次）12鄰苯二甲酸氫鉀質(zhì)/g0.30280.3024消耗NaOH體積/mL16.3416.30NaOH濃度/(mol/L)0.090740.09084平均值/mol/L0.09079（2）1%酚酞指示劑稱取酚酞1g溶解于100ml95%乙醇中。變色范圍pH（8.2-10.0）。（3）測定滴定用移液槍吸取菌液5ml，注入三角瓶中，加入45ml的蒸餾水，加入酚酞指示劑3-5滴。用0.09079mol/L的NaOH溶液滴定至淺（微）紅色且30秒不褪色。記錄消耗的NaOH量。2.2.9（一）樣品的處理和稀釋：1．操作方法：以無菌操作取菌液1ml，放于9mL滅菌生理鹽水試管內(nèi)，經(jīng)充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1：10的均勻稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。另取1ml滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。2．無菌操作：操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的，不得殘留有細(xì)菌或抑菌物質(zhì)。所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行消毒處理。樣品如果有包裝，應(yīng)用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺(tái)或經(jīng)過消毒處理的無菌室進(jìn)行。瓊脂平板在工作臺(tái)暴露15分鐘，每個(gè)平板不得超過15個(gè)菌落。3．采樣的代表性：如系固體樣品，取樣時(shí)不應(yīng)集中一點(diǎn)，宜多采幾個(gè)部位。固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。4．樣品稀釋誤差：為減少樣品稀釋誤差，在連續(xù)遞次稀釋時(shí)，每一稀釋液應(yīng)充分振搖，使其均勻，同時(shí)每一稀釋度應(yīng)更換一支吸管。在進(jìn)行連續(xù)稀釋時(shí)，應(yīng)將吸管內(nèi)液體沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內(nèi)。為減少稀釋誤差，SN標(biāo)準(zhǔn)采用取10mL稀釋液，注入90mL緩沖液中。5．稀釋液：樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，有的采用磷酸鹽緩沖液（或0.1％蛋白胨水），后者對食品已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進(jìn)行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。（二）傾注培養(yǎng)1．操作方法：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì)，選擇2~3個(gè)適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋的同時(shí)，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻。同時(shí)將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，取出計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。2．傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46℃水浴內(nèi)保溫，溫度過高會(huì)影響細(xì)菌生長，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察。3．為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。4．培養(yǎng)溫度一般為37℃（水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，故多采用30℃）。培養(yǎng)時(shí)間一般為48h，有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計(jì)數(shù)。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過15％。5．為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便計(jì)數(shù)時(shí)作對照觀察。在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。注意事項(xiàng)：（1）操作要快而準(zhǔn)，包括材料、加樣、倒培養(yǎng)基。（2）吸液體時(shí)液體不能進(jìn)入吸頭。（3）樣品稀釋時(shí)一定要混勻。（4）倒培養(yǎng)基前，瓶口要過火焰。（5）一定要有空白對照。（6）培養(yǎng)基溫度控制，培養(yǎng)基薄厚。（7）檢測時(shí)一定要使平皿完全暴露于空氣中。（三）計(jì)數(shù)和報(bào)告1．操作方法：培養(yǎng)到時(shí)間后，計(jì)數(shù)每個(gè)平板上的菌落數(shù)?？捎萌庋塾^察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計(jì)算處原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數(shù)，進(jìn)行報(bào)告。2．到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。3．計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間的平板（SN標(biāo)準(zhǔn)要求為25~250個(gè)菌落），若有二個(gè)稀釋度均在30~300之間時(shí)，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字（有的規(guī)定不考慮其比值大小，均以平均數(shù)報(bào)告）。4．若所有稀釋度均不在計(jì)數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之間，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如所有稀釋度均無菌落生長，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。有的規(guī)定對上述幾種情況計(jì)算出的菌落數(shù)按估算值報(bào)告。5．不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個(gè)平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗(yàn)中的差錯(cuò)（有的食品有時(shí)可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應(yīng)作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。6．當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時(shí)，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個(gè)菌落計(jì)，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算，不要把鏈上生長的每一個(gè)菌落分開計(jì)數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。7．當(dāng)計(jì)數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時(shí)），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計(jì)數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。8．菌落數(shù)的報(bào)告，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定菌落數(shù)在1~100時(shí)，按實(shí)有數(shù)字報(bào)告，如大于100時(shí)，則報(bào)告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計(jì)算。固體檢樣以克（g)為單位報(bào)告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報(bào)告，表面涂擦則以平方厘米（cm）報(bào)告。2.2.7以優(yōu)化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，進(jìn)行生長動(dòng)力學(xué)研究，選用Logistic方程作為細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)模型。3結(jié)果與討論3.1培養(yǎng)基碳、氮源的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：時(shí)間/hOD值0.00.3642.00.3934.00.5106.00.6878.00.93310.01.22412.01.47514.01.63516.01.74718.01.86120.01.89822.01.98624.01.97826.01.92528.01.85230.01.87432.01.94634.01.82736.01.80938.01.81640.01.780由實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，嗜酸乳桿菌在22h左右OD值達(dá)到最大，即其活菌數(shù)達(dá)到最高。碳源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3-1時(shí)間/h碳源0.016.018.020.022.024.026.0（稀釋5倍）葡萄糖0.3641.8611.9171.9861.9781.9250.755海藻糖0.3981.8461.9671.9851.974蔗糖0.3881.1241.2341.4821.308淀粉1.3121.3461.2951.061麥芽糖0.7801.3841.2831.4471.3691.321果糖0.4341.8471.9011.9141.9751.912乳糖0.0361.6411.7761.8701.9271.9480.811低聚果糖0.7921.2481.2601.3181.5301.558從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，最優(yōu)的碳源為葡萄糖。氮源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2-4時(shí)間/h名稱16.018.020.022.024.027.028.0魚粉代牛肉膏1.1581.1941.3501.4051.4441.402魚粉代酵母1.0001.0081.0811.0901.0651.041魚粉代藥蛋白0.5911.7751.8421.8721.9131.846胰蛋白代牛肉膏0.3221.5101.5721.6301.7041.746胰蛋白代酵母1.3211.3361.3841.4121.4101.338胰蛋白代藥蛋白0.4251.7761.8581.8871.9131.909KNO3代牛肉膏1.0521.1381.3121.3231.3321.319KNO3代酵母1.1861.2141.3301.3291.3301.309KNO3代藥蛋白1.6601.7641.8751.8661.8011.784時(shí)間/h名稱18.020.022.024.025.026.0月示蛋白代牛肉膏1.7061.7401.4041.7201.6671.670月示蛋白代酵母1.4071.3751.0231.4391.4231.410月示蛋白代藥蛋白1.6941.6961.2471.6121.6621.610酪蛋白代牛肉膏1.2541.3271.4291.4471.4341.471酪蛋白代代酵母1.1911.1691.1681.1411.1341.133酪蛋白代藥蛋白0.8300.8400.8310.8070.8150.820大豆蛋白代牛肉膏1.9800.420（稀釋10倍）0.404（稀釋10倍）0.452（稀釋10倍）0.482（稀釋10倍）0.409（稀釋10倍）大豆蛋白代酵母1.7931.7961.7961.8071.8001.721大豆蛋白代藥蛋白0.393（稀釋10倍）0.407（稀釋10倍）0.403（稀釋10倍）0.431（稀釋10倍）0.443（稀釋10倍）0.330（稀釋10倍）硫酸銨代牛肉膏1.3671.4441.4931.5261.5201.499硫酸銨代酵母1.1831.2081.3691.2021.2191.177硫酸銨代藥蛋白1.6771.7051.6931.7401.7171.721從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，最優(yōu)的氮源為大豆蛋白胨代替牛肉膏。3.2培養(yǎng)基不同碳氮源之間搭配的優(yōu)化優(yōu)化結(jié)果如表3-2時(shí)間/h名稱14.016.018.020.022.0乳糖代替葡萄糖及大豆蛋白胨代替牛肉膏1.2470.3020.3400.3480.276乳糖代替葡萄糖及胰蛋白胨代替藥理學(xué)蛋白胨0.7670.1520.1620.1800.187乳糖代替葡萄糖及大豆蛋白胨代替藥理學(xué)蛋白胨1.1000.2920.2920.3170.302葡萄糖及大豆蛋白胨代牛肉膏1.9220.3580.3600.3700.091葡萄糖及大豆蛋白胨代替藥理學(xué)蛋白胨0.1780.0540.0540.0540.056葡萄糖及胰蛋白胨代替藥理學(xué)蛋白胨1.1320.1860.1890.1890.188果糖代替葡萄糖及大豆蛋白胨代牛肉膏1.7280.2940.2890.2040.069果糖代替葡萄糖及胰蛋白胨代替藥理學(xué)蛋白胨1.0440.1800.1860.2000.194果糖代替葡萄糖及大豆蛋白胨代替藥理學(xué)蛋白胨1.6230.2780.2780.2550.0663.3培養(yǎng)基增值因子的優(yōu)化結(jié)果增值因子的優(yōu)化結(jié)果如表3-3時(shí)間/h名稱16.018.020.022.024.026.0維生素B10.02%0.3430.2400.3940.3640.3700.364維生素B10.04%0.3080.2920.3470.3430.3390.334維生素B50.02%0.3880.3870.4140.4140.4340.421維生素B50.04%0.3070.3720.4080.4000.3860.390谷氨酸0.5%0.1130.2130.3300.3240.3120.320谷氨酸1%0.1000.1310.2380.2340.2330.230蛋氨酸0.5%0.3410.3410.3700.3730.3760.374蛋氨酸0.01%0.3340.2110.3200.3660.3580.3643.3培養(yǎng)基靜態(tài)培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果3.3.1培養(yǎng)溫度的優(yōu)化結(jié)果如表3-4時(shí)間/h溫度/℃16.018.020.022.024.026.0350.1450.1620.1780.1970.2160.220370.1680.1820.1960.2140.2280.236390.2020.2200.2340.2500.2520.277實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度在39℃時(shí)菌體密度能達(dá)到最大，所以該溫度是嗜酸乳桿菌的最佳培養(yǎng)溫度。3.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3-5時(shí)間/h接種量/%16.018.020.022.024.026.020.1900.2300.2560.2700.2850.18440.2200.2540.2720.2900.2980.18460.2320.2640.2810.2840.3100.192實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著接種量的增加，OD值也逐漸變大，當(dāng)接種量為2%時(shí)最大OD值為0.285；接種量為4%時(shí)，最大OD值為0.298。而4%與6%的接種量菌液OD值差異不大，從生產(chǎn)成本考慮本次實(shí)驗(yàn)采用了4%的接種量。嗜酸乳桿菌主要息居與人和動(dòng)物的腸、胃，以及人的口腔和陰道中，是胃腸道主要的菌群之一。[1]楊潔冰，郭興華，凌代文等.1996.乳酸菌—生物學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用.北京：中國輕工業(yè)出版社.[2]鄭堅(jiān)強(qiáng)，司俊玲.改善嗜酸乳桿菌酸乳風(fēng)味的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2006，（2）：13-15.[3]郭本恒.嗜酸乳桿菌在乳品中的應(yīng)用技術(shù)[J].食品工業(yè)，1999，1：18-19.[4]郭本恒．益生菌．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004．[5]VandhoofJA，YongRJ.Useofprobioticsinchildhoodgastrointestinal[J].JPediatrcastroenterolNutr，1998，27：323—332．[6]Yamaski．S．ImmunologyicalresponsetomonoassociatedBifibacteriumlongumandtheirrelationtopreventionofbacterialinvasion．Immunology，1985，56：43—50.[7]趙瑞香等．嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳保藏性的研究．中國乳品工業(yè)，2001，29(6)：11—13.[8]HENGESDJ．Probiotics：TheScientificBasis[M]．London：ChapmanandHall，1992：87—109．[9]DrasarBSHillJF．1972．Intestinalbacteriaandcancer．Amer．J．Clin．Nutr，25：1399—1404.[10]BogdanovEGDalvePG．1975．AntitumorglycopeptidesfromLactobacillusbulgaricuscellwall．FEBSLett，57：259—261．[11]HosonoK．1986．Functionofthenormalhumanmicroflora．Sacand．J．Infet．DiS．49：17—30.[12]HawthornReid．1988．Anti—tumoractivityofLactobacilliinvitro．MicrobiosLett．39：105-112.[13]GillilandSE．WaIkerDK．1990．Factortoconsiderwhenselectingacultureoflactobaciflusacidophilusasadietaryadjuncttoproduceahypocholester01emiceffectinhuman，DiarySci，73：905—911.[14]GillilandSE，NelsonCR，MaxwellC．1985．AssimilationofcholesterolbyLactobacillusacidophilus．Appl．Environ．Microbiol，49：377—381.[15]LinSY，AyresJW，WinklerWeta1．1989。Lactobacilluseffectsoncholesterol;invitroresults．DairySci．72：2885—2889.[15]ThompsonLU，JenkinsDJ，AAmerMAVeta1．1982.Theeffectoffermentedandunfermentedmilksonserumcholesterol．Amer．J．CLIN．Nytr．36：1106—1111.[16]駱承癢．．乳與乳制品工藝學(xué)。北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999．[17]SandineWE．RoleofLactobacillusintheintestinaltract．FoodProt，1979，42：259—262.[18]NilsonKM，DulieAH，DuthieAEeta1．AnidealvehicleforLactobacillusacidophilus．DairyField．1983，164：139.[19]郭本恒．益生菌．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004．[20]陳駒聲．乳品加工技術(shù)．北京：中國輕工業(yè)出版社，2000.[21]趙瑞香.嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用研究.北京：科學(xué)出版社，2007：174-179.[22]GregorDeidetal.2001.Canbacteriainferencepreventinfection?TrendinMicrobiology,9（9）：424.[23]郭本恒．益生菌．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004．[24]郭興華.2002.益生菌—基礎(chǔ)與應(yīng)用.北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社.[25]伍時(shí)華，黃翠姬，黃瑤，易弋，廖蘭．微生物指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)書[M]．廣西工學(xué)院生化系：廣西工學(xué)院生化系，29-36．基于C8051F單片機(jī)直流電動(dòng)機(jī)反饋控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與研究基于單片機(jī)的嵌入式Web服務(wù)器的研究MOTOROLA單片機(jī)MC68HC（8）05PV8/A內(nèi)嵌EEPROM的工藝和制程方法及對良率的影響研究基于模糊控制的電阻釬焊單片機(jī)溫度控制系統(tǒng)的研制基于MCS-51系列單片機(jī)的通用控制模塊的研究基于單片機(jī)實(shí)現(xiàn)的供暖系統(tǒng)最佳啟停自校正（STR）調(diào)節(jié)器單片機(jī)控制的二級倒立擺系統(tǒng)的研究基于增強(qiáng)型51系列單片機(jī)的TCP/IP協(xié)議棧的實(shí)現(xiàn)基于單片機(jī)的蓄電池自動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)基于32位嵌入式單片機(jī)系統(tǒng)的圖像采集與處理技術(shù)的研究基于單片機(jī)的作物營養(yǎng)診斷專家系統(tǒng)的研究基于單片機(jī)的交流伺服電機(jī)運(yùn)動(dòng)控制系統(tǒng)研究與開發(fā)基于單片機(jī)的泵管內(nèi)壁硬度測試儀的研制基于單片機(jī)的自動(dòng)找平控制系統(tǒng)研究基于C8051F040單片機(jī)的嵌入式系統(tǒng)開發(fā)基于單片機(jī)的液壓動(dòng)力系統(tǒng)狀態(tài)監(jiān)測儀開發(fā)模糊Smith智能控制方法的研究及其單片機(jī)實(shí)現(xiàn)一種基于單片機(jī)的軸快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于雙單片機(jī)沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究基于CYGNAL單片機(jī)的在線間歇式濁度儀的研制基于單片機(jī)的噴油泵試驗(yàn)臺(tái)控制器的研制基于單片機(jī)的軟起動(dòng)器的研究和設(shè)計(jì)基于單片機(jī)控制的高速快走絲電火花線切割機(jī)床短循環(huán)走絲方式研究基于單片機(jī)的機(jī)電產(chǎn)品控制系統(tǒng)開發(fā)基于PIC單片機(jī)的智能手機(jī)充電器基于單片機(jī)的實(shí)時(shí)內(nèi)核設(shè)計(jì)及其應(yīng)用研究基于單片機(jī)的遠(yuǎn)程抄表系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與研究基于單片機(jī)的煙氣二氧化硫濃度檢測儀的研制基于微型光譜儀的單片機(jī)系統(tǒng)單片機(jī)系統(tǒng)軟件構(gòu)件開發(fā)的技術(shù)研究基于單片機(jī)的液體點(diǎn)滴速度自動(dòng)檢測儀的研制基于單片機(jī)系統(tǒng)的多功能溫度測量儀的研制基于PIC單片機(jī)的電能采集終端的設(shè)計(jì)和應(yīng)用基于單片機(jī)的光纖光柵解調(diào)儀的研制氣壓式線性摩擦焊機(jī)單片機(jī)控制系統(tǒng)的研制基于單片機(jī)的數(shù)字磁通門傳感器基于單片機(jī)的旋轉(zhuǎn)變壓器-數(shù)字轉(zhuǎn)換器的研究基于單片機(jī)的光纖Bragg光柵解調(diào)系統(tǒng)的研究單片機(jī)控制的便攜式多功能乳腺治療儀的研制基于C8051F020單片機(jī)的多生理信號檢測儀基于單片機(jī)的電機(jī)運(yùn)動(dòng)控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)Pico專用單片機(jī)核的可測性設(shè)計(jì)研究基于MCS-51單片機(jī)的熱量計(jì)基于雙單片機(jī)的智能遙測微型氣象站MCS-51單片機(jī)構(gòu)建機(jī)器人的實(shí)踐研究基于單片機(jī)的輪軌力檢測基于單片機(jī)的GPS定位儀的研究與實(shí)現(xiàn)基于單片機(jī)的電液伺服控制系統(tǒng)用于單片機(jī)系統(tǒng)的MMC卡文件系統(tǒng)研制基于單片機(jī)的時(shí)控和計(jì)數(shù)系統(tǒng)性能優(yōu)化的研究基于單片機(jī)和CPLD的粗光柵位移測量系統(tǒng)研究單片機(jī)控制的后備式方波UPS提升高職學(xué)生單片機(jī)應(yīng)用能力的探究基于單片機(jī)控制的自動(dòng)低頻減載裝置研究基于單片機(jī)控制的水下焊接電源的研究基于單片機(jī)的多通道數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于uPSD3234單片機(jī)的氚表面污染測量儀的研制基于單片機(jī)的紅外測油儀的研究96系列單片機(jī)仿真器研究與設(shè)計(jì)基于單片機(jī)的單晶金剛石刀具刃磨設(shè)備的數(shù)控改造基于單片機(jī)的溫度智能控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)基于MSP430單片機(jī)的電梯門機(jī)控制器的研制基于單片機(jī)的氣體測漏儀的研究基于三菱M16C/6N系列單片機(jī)的CAN/USB協(xié)議轉(zhuǎn)換器基于單片機(jī)和DSP的變壓器油色譜在線監(jiān)測技術(shù)研究基于單片機(jī)的膛壁溫度報(bào)警系統(tǒng)設(shè)計(jì)基于AVR單片機(jī)的低壓無功補(bǔ)償控制器的設(shè)計(jì)基于單片機(jī)船舶電力推進(jìn)電機(jī)監(jiān)測系統(tǒng)基于單片機(jī)網(wǎng)絡(luò)的振動(dòng)信號的采集系統(tǒng)基于單片機(jī)的大容量數(shù)據(jù)存儲(chǔ)技術(shù)的應(yīng)用研究基于單片機(jī)的疊圖機(jī)研究與教學(xué)方法實(shí)踐基于單片機(jī)嵌入式Web服務(wù)器技術(shù)的研究及實(shí)現(xiàn)基于AT89S52單片機(jī)的通用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于單片機(jī)的多道脈沖幅度分析儀研究機(jī)器人旋轉(zhuǎn)電弧傳感角焊縫跟蹤單片機(jī)控制系統(tǒng)基于單片機(jī)的控制系統(tǒng)在PLC虛擬教學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用研究基于單片機(jī)系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)通信研究與應(yīng)用HYPE