培養(yǎng)基成分對彭澤貝母愈傷組織增殖及生物堿含量的影響【摘要】目的研究MS培養(yǎng)基中大量元素、微量元素對彭澤貝母愈傷生長及生物堿含量的影響，篩選有利于彭澤貝母愈傷組織生長和生物堿積累的培養(yǎng)基配方。方法采用正交和單因素實驗設(shè)計，以生長40d的彭澤貝母愈傷組織的生長率和生物堿含量為指標(biāo)，評價各因素對其影響的大小。結(jié)果各因素對彭澤貝母愈傷組織生長影響大小依次為PCaKN,對生物堿積累影響大小依次為KNCaP；培養(yǎng)基中NO3-N含量較高時，有利于生物堿的積累；微量元素缺乏時均有利于彭澤貝母愈傷組織的生長，缺Cu、缺I時不利于生物堿的積累。結(jié)論有利于彭澤貝母愈傷組織生長和生物堿積累的最佳組合分別為：N3P1K3Ca2、N1P2K3Ca1；培養(yǎng)基中大量元素、微量元素對彭澤貝母愈傷組織生長及生物堿含量存在一定影響。

【關(guān)鍵詞】彭澤貝母愈傷組織生長量生物堿

Abstract：ObjectiveTostudytheeffectoflargeelements,traceelementsofMSculturemediumonthegrowthandalkaloidcontentofFritillariamonanthaMigocallus,andtoselecttheculturemediumwhichisadvantageousinitsgrowthandalkaloidthegrowthrateandalkaloidcontentofthe40days‘callusasindexes,single-factorandorthogonalexperimentaldesignwasconductedtoevaluatetheimpactofvariouseffectofvariousfactorsonthegrowthofthecallusisPCaKN,andonthealkaloidswasKNCaP;thealkaloidcontentwashigherwhentheproportionofNO3-NwashigherthanNH+4-N；Lacingtraceelementswerealladvantageousingrowthofthecallus，butlacingIandCuwerenothelpfultotheaccumulationofalkaloids.ConclusionThebestcombinationofthevariousfactorsforthegrowthandtheaccumulationofalkaloidsofthecallusrespectivelyis:N3P1K3Ca2、N1P2K3Ca1；largeelements,traceelementsofMSculturemediumhaveeffectsonthegrowthandalkaloidcontentofFritillariamonanthaMigocallus.

Keywords：FritillariamonanthaMigo;Callus;Alkaloids;Growth

江西彭澤貝母FritillariamonanthaMigo主產(chǎn)于江西北部的彭澤、湖口、都昌、九江、瑞昌、修水等縣，已被確定為國產(chǎn)貝母屬植物在江西的新分布,彭澤貝母作川貝母使用已有多年的歷史，藥研究表明，彭澤貝母的藥理、藥效接近甚至優(yōu)于幾種常用貝母。近年來，其需求量增大，人們過度采挖，導(dǎo)致其野生蘊藏量銳減，加上人工栽培條件嚴格，有性繁殖年限長，無性繁殖系數(shù)低，病蟲害防治難等，不能滿足人們長期用藥的需求。隨著近年來對植物生物化學(xué)研究的深入，利用植物細胞、組織或器官培養(yǎng)獲得并優(yōu)化藥用植物次生代謝產(chǎn)物，以及最終利用遺傳工程制取次生代謝產(chǎn)物以滿足人類對藥用植物的巨大需求，已成為當(dāng)前藥用植物生物技術(shù)領(lǐng)域的研究。大規(guī)模藥用植物組織培養(yǎng)技術(shù)的成功，使藥用植物組織細胞培養(yǎng)技術(shù)在中藥領(lǐng)域得到了更深的研究和。本課題組研究了不同激素組合對彭澤貝母愈傷組織誘導(dǎo)的影響，并對其高產(chǎn)細胞做了篩選［1，2］。本文在此基礎(chǔ)上研究了MS培養(yǎng)基中無機成分對其生長及生物堿含量的影響，為進一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與儀器

材料為本實驗室繼代培養(yǎng)的疏松的彭澤貝母愈傷組織。

藥品貝母素甲購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110750-200607；氯仿、甲醇、氨水、溴甲酚綠、鄰苯二甲酸氫鉀等均為分析純。

儀器UV7501紫外/可見分光光度計；SW-CJ-2F醫(yī)用凈化臺；PB303-N電子天平；全自動高壓蒸氣滅菌鍋等。

2方法

培養(yǎng)條件以MS為基本培養(yǎng)基，NAAmg/L+mg/L+KT/L為激素組合置于溫度℃，光照強度為1000-1500lx，濕度為100%光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

生長量測定接種和取材前后均稱量培養(yǎng)基的重量,計算接種量、收獲量和增長率：接種量=接種后瓶重(g)-接種前瓶重(g)，收獲量=收獲前瓶重(g)-收獲后瓶重(g)，生長率=收獲量(g)×100／接種量(g)。

對其生長及生物堿含量的影響以N，P，K，Ca為4個因素，MS培養(yǎng)基中原濃度、1/2濃度、1/4濃度3個水平，采用正交設(shè)計L9(34)進行實驗，培養(yǎng)40d后取出材料，測定生長率和生物堿含量。表1N，P，K，Ca含量正交設(shè)計因素水平表

NH4+-N與NO3-N對愈傷組織生長及生物堿含量的影響培養(yǎng)基中的氮源改用KNO3和NH4Cl，總N濃度不變，研究其不同比例對彭澤貝母愈傷組織生長及生物堿含量的影響，處理見表2。表2銨態(tài)N與硝態(tài)N對其生長及生物堿含量的影響

微量元素缺乏對彭澤貝母愈傷組織生長及生物堿含量的影響以MS培養(yǎng)基為對照，把彭澤貝母愈傷組織接種到分別不加Fe，Mn，B，Mo，Zn，I，Co，Cu的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40d后，取出材料測定生長率和生物堿含量。

生物堿的提取與含量測定生物堿的提取與含量測定參考劉紅寧［3］、上官一平［4］等的方法，并在此基礎(chǔ)上做了改進。

試劑的配制pH鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液：稱取4g鄰苯二甲酸氫鉀，加熱溶解并定容至100ml，用mol/LNaOH溶液調(diào)至pH。

%溴甲酚綠溶液配制：精密稱取溴甲酚綠80mg，加入少量1mol/LNaOH溶液溶解，定容至200ml,置陰暗處備用。

標(biāo)準溶液的配制精密稱取浙貝甲素3g置于25ml容量瓶中，加氯仿溶解，定容，得浙貝甲素標(biāo)準溶液。

標(biāo)準曲線的制備精密吸取浙貝甲素標(biāo)準液1，3，5，7，9ml，用氯仿定容至10ml,分別置分液漏斗中，加水10ml，溴甲酚綠溶液2ml和鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液2ml，再精密加入三氯甲烷20ml，密塞，搖勻，靜置30min，分取氯仿層。另取氯仿10ml，同法操作，所得氯仿層為空白，在411nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，得回歸方程Y=+5,R2=8。見1。

最大吸收波長選擇取1ml標(biāo)準溶液萃取的氯仿層，照紫外-可見分光光度法在200～800nm波長范圍內(nèi)進行掃描，此對照品在411nm波長處有最大吸收峰，故選擇411nm為測定波長。

樣品處理取彭澤貝母愈傷于60℃干燥至恒重，粉碎，過4號篩，精密稱取貝母粉末g，用10%氨水2ml濕潤30min，加混合溶劑20ml超聲提取40min，過濾，濾液于60°C水浴蒸干，再用氯仿溶解，置分液漏斗中，加水10ml，溴甲酚綠溶液2ml和鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液2ml，再精密加入三氯甲烷，密塞，搖勻，靜置30min，分取氯仿層，并定容至50ml,另取氯仿30ml，同法操作，所得氯仿層為對照。

3結(jié)果

培養(yǎng)基中N、P、K、Ca含量對愈傷組織生長及生物堿含量的影響見表3。從表3可以看出，處理7愈傷組織增長率最大,為%,處理3最小,僅為%；而生物堿含量最高的為處理3,含量為%,最小的為處理4，僅為%。通過直觀極差比較可知，RPRCaRKRN，RK′RN′RCa′RP′，表明各因素中對彭澤貝母愈傷組織生長的影響大小依次為PCaKN，而對生物堿積累影響大小則為KNCaP，有利于彭澤貝母愈傷組織生長的最佳組合為：N3P1K3Ca2，有利于彭澤貝母愈傷組織生物堿積累的最佳組合為：N1P2K3Ca1。表3N、P、K、Ca含量對其生長及生物堿含量的影響

銨態(tài)N與硝態(tài)N對愈傷組織增殖及生物堿含量的影響見表4。從表4可以看出,處理5彭澤貝母愈傷組織的平均增長率最高為%,即NH4+/N03-為1/2時，其次為處理3為%,即NH4+/N03-為2/1時，當(dāng)培養(yǎng)基中僅為NH4+-N時，增長率只有%，增長率最小的為空白對照，僅為%；當(dāng)NH4+/N03-為1/2時生物堿含量最高，達到%，培養(yǎng)基中NH4+/N03-為1/2、1/4、僅N0-3-N時，生物堿含量均高于其他處理，在空白對照中生物堿含量最低。由此表明Ｎ源對彭澤貝母愈傷組織的生長分化及生物堿的積累是有一定影響的，只有當(dāng)不同形態(tài)的Ｎ源比例適宜時，才有利于愈傷組織的增殖和生物堿的積累。表4銨態(tài)N與硝態(tài)N對其生長及生物堿含量的影響

微量元素缺乏對彭澤貝母愈傷組織增殖及生物堿含量的影響見圖2～3。從圖中可以看出，缺乏微量元素均有利于彭澤貝母愈傷組織的增殖，其中缺Co時增長率達到%，生物堿含量遠遠高于對照；缺Zn、缺Fe時生物堿含量最高，達到了%，缺I、缺Cu不利于生物堿的積累。

4討論

培養(yǎng)基的組成是植物生長的一個決定因素，不同植物對培養(yǎng)基有不同的要求，并對培養(yǎng)基中的不同成分有不同的敏感性。本試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MS培養(yǎng)基中NO-3-N的比例增高時有利于彭澤貝母愈傷組織中生物堿的積累。

微量元素在植物細胞生長中起著不可替代的作用，它們大多是酶的組成成分或活化劑，缺少其中一種就會代謝受阻，但是植物對其的需要量甚微，稍多就發(fā)生毒害。本文研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中缺B、缺Zn、缺Cu、缺Mo、缺Co、缺Mn、缺Fe、缺I時均有利于彭澤貝母愈傷組織的生長，但是缺Cu、缺I時不利于生物堿的積累，與近幾年研究的植物逆境有利于中藥有效成分的積累相一致［5］。

【參考文獻】

［1］張壽文,劉賢旺,黃慧蓮，等.不同激素組合對彭澤貝母愈傷組織誘導(dǎo)效應(yīng)的研究［J］.江西中院學(xué)報,2004,16(4):52.

［2］張壽文,雷志強