包涵體蛋白的提取與純化摘要：隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展及越來越多的功能基因被發(fā)現(xiàn)和克隆,蛋白質(zhì)異源表達(dá)已被廣泛應(yīng)用。大腸桿菌因遺傳背景清楚、成本低、操作簡(jiǎn)單,且能高效表達(dá)外源基因等特點(diǎn),是基礎(chǔ)研究、臨床應(yīng)用及工業(yè)生產(chǎn)蛋白和多肽的首選表達(dá)系統(tǒng)。然而,重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)經(jīng)常形成無活性的不溶性聚集物即包涵體。包涵體的形成有一定的優(yōu)勢(shì),如具有高蛋白密度、易分離、易于毒性蛋白和宿主細(xì)胞致死蛋白表達(dá)等特點(diǎn)［1~3］。因此,如何將包涵體蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘目扇艿鞍资莻涫荜P(guān)注的問題。從包涵體中獲得天然活性的重組蛋白一般包括三個(gè)步驟:包涵體的分離和洗滌、包涵體的溶解、包涵體蛋白的復(fù)性。本文綜述了近年來包涵體蛋白分離純化和色譜法復(fù)性技術(shù)研究進(jìn)展,期望包涵體蛋白體外折疊這一難題早日解決。正文：1．包涵體的形成重組蛋白不論在原核細(xì)胞還是真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，都可形成包涵體［4］。通常所說的包涵體是指重組蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)形成的無活性蛋白聚集體，一般含有50%以上重組蛋白，其余為核糖體組分、RNA聚合酶，外膜蛋白等雜蛋白，以及質(zhì)粒DNA、RNA片斷、脂質(zhì)、肽聚糖、脂多糖等成分［5，6］。由于包涵體在相差顯微鏡下為黑色斑點(diǎn)，所以也稱為折射體(Refractilebody)［7］。包涵體形成的原因主要有以下幾點(diǎn):蛋白合成速度太快，以致于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊。蛋白折疊的動(dòng)力學(xué)模型表明:蛋白質(zhì)天然構(gòu)象形成的速率取決于肽鏈的合成速率、折疊速率和聚集速率幾個(gè)因素。中間體正確折疊是分子內(nèi)的一級(jí)反應(yīng)，而中間體的聚集是發(fā)生在分子間的二級(jí)或高級(jí)反應(yīng)，因此，折疊中間體的濃度對(duì)聚集反應(yīng)影響非常大［8］；:重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺少真核生物的翻譯后修飾系統(tǒng)(如糖基化等)，致使中間體大量積累，容易形成包涵體［9］；培養(yǎng)條件不佳和重組蛋白所處的環(huán)境也可導(dǎo)致包涵體形成，如發(fā)酵溫度高，胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)等［10］；??二硫鍵在蛋白折疊中有重要作用，而大腸桿菌胞內(nèi)的還原環(huán)境不利于二硫鍵的形成［2］；?包涵體不溶可能由于分子間無活性的B-片層含量高于天然結(jié)構(gòu)或鹽沉淀蛋白［11］。包涵體蛋白雖然不具有天然結(jié)構(gòu)、沒有活性，但在基因工程中生產(chǎn)重組蛋白，包涵體的形成有一定優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在:重組蛋白高水平表達(dá)，有時(shí)候可達(dá)細(xì)胞總蛋白的30%［2］；；包涵體密度高(約1。3mg/ml)［12］，重組蛋白相對(duì)較純，很容易與細(xì)胞成分分離，可減少后續(xù)純化步驟；包涵體結(jié)構(gòu)致密，因而在一定程度上避免了大腸桿菌蛋白酶的降解；易于毒性蛋白和膜蛋白表達(dá)［3，8］；包涵體的形成降低了重組蛋白在胞質(zhì)中的濃度，有利于目的基因的進(jìn)一步表達(dá)。基于這些特點(diǎn)，重組蛋白的包涵體表達(dá)已在商業(yè)化生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。2.包涵體蛋白的溶解和去折疊溶解包涵體目前最常用的方法是用變性劑如尿素(6~8mol/L)或鹽酸胍(4~6mol/L)溶解，它們對(duì)蛋白質(zhì)的氫鍵有較強(qiáng)的可逆性變性作用,可破壞蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu),或伸展肽鏈分子之間的相互作用,使其去折疊。尿素具有不電離、成本低、可直接進(jìn)行SDS檢測(cè)以及溶解的包涵體蛋白可選用多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用,但尿素容易析出,作用時(shí)間較長(zhǎng)或溫度較高時(shí)會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)修飾。鹽酸胍溶解包涵體能力較尿素強(qiáng),作用快而不修飾蛋白,但成本高,酸性條件下易沉淀,還干擾離子交換色譜等。一般來說,用低濃度變性劑溶解包涵體得到的可溶性蛋白純度比高濃度變性劑溶解的高,是因?yàn)樽冃詣舛雀邥r(shí)胞質(zhì)顆粒蛋白也被釋放出來[9]。包涵體溶解還可添加去污劑[23,25]、還原劑[15,26]、螯合劑[26]等,或在極端pH、高溫條件下進(jìn)行[18]。各種去污劑如SDS,CTAB,Tween20,NP40,TritionX-100,Sarkosyl月桂酰-N-甲基氨基乙酸鈉)等常被用來溶解包涵體是因?yàn)槠渥饔帽塞}酸胍和尿素更溫和,溶解的蛋白質(zhì)具有更多的有序結(jié)構(gòu),可能已經(jīng)具有生物活性,避免了復(fù)性中的錯(cuò)誤折疊。但是使用去污劑作為溶解劑可能會(huì)干擾后續(xù)純化步驟[9]對(duì)于含有半胱氨酸的重組蛋白質(zhì),分離到的包涵體中常含有一些鏈間和鏈內(nèi)非活性的二硫鍵,因此還原劑的使用非常重要。常用的還原劑有DTT、DTE、GSH、B-巰基乙醇，還原劑可以過量，以保證半胱氨酸還原完全。EDTA,EGTA等鰲合劑也被用來阻止金屬離子催化的空氣氧化反應(yīng),硫化物的形成或二硫化物混和物也可保護(hù)被還原的半胱氨酸[27]。利用極端pH也可溶解包涵體。Gavit等[18]將低pH([2.6)和高溫(85e)相結(jié)合,并通過在位溶解的方式溶解抗真菌重組多肽包涵體。3．體外輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法蛋自折疊是垂組蛋自大規(guī)模復(fù)性的關(guān)鍵步驟I'SJ。日前,變性蛋白質(zhì)體外復(fù)性的力一法k要有傳統(tǒng)的輔助復(fù)性法如稀釋法、透析法1'“1、超濾法｝'7］以及新發(fā)展的液相色譜(Lc)法或稱為蛋自質(zhì)折疊液相色譜法(PFLC),也有在此基礎(chǔ)上模擬體內(nèi)分子伴侶、折異酶、人」二分子伴侶、反膠束的輔助艾性方法。4.傳統(tǒng)體外輔助蛋白質(zhì)的復(fù)性稀釋法、透析法和超濾法是蛋白質(zhì)在溶液中直接進(jìn)行體外蛋自復(fù)性的方法。其中稀釋法是最簡(jiǎn)單、使用頻率最高的蛋白質(zhì)復(fù)性方法。通過加入復(fù)性緩沖液直接的、高倍數(shù)的降低變性劑濃度,為蛋自質(zhì)提供折疊環(huán)境。可以說無論是利用模型標(biāo)汀卜蛋白來研究變性蛋白的復(fù)性,還是重組的包涵體蛋自復(fù)性的研究,稀釋法都是首選的方法。蛋白質(zhì)折疊是分子內(nèi)的一級(jí)反應(yīng)過程,而聚集體的生成則為二級(jí)以上的反應(yīng)過程。蛋白質(zhì)的濃度的降低有利于提高蛋白質(zhì)復(fù)性回收率,而當(dāng)變性劑的濃度降低到一定程度時(shí),一些抑制劑會(huì)失去抑制蛋白聚集的作用，從而導(dǎo)致蛋白重新聚集1'8,'9］。所以稀釋復(fù)性過程中，稀釋倍數(shù)也是一個(gè)非常關(guān)鍵的參數(shù)。但是,在稀釋法復(fù)性過程,掃,稀釋體積大比例的增加為復(fù)性蛋白的后處理帶來了困難,通常回收率較低。透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜,一而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì),達(dá)到分離效果的方法。在蛋白質(zhì)復(fù)性中可借助于蛋白質(zhì)分離的同時(shí),在去除溶液中分子量小的雜質(zhì)而達(dá)到復(fù)性的目的。此法缺點(diǎn)是抓環(huán)費(fèi)時(shí),且在膜內(nèi)目標(biāo)蛋自仍會(huì)形成沉淀而聚集,'常被用于其它復(fù)性方法之后小分子物質(zhì)去除。超濾法是一種膜濾法,以多孔的薄膜作為介質(zhì),利用薄膜兩側(cè)的壓力差來分離溶液,不同分子量的物質(zhì)。稀釋法和透析法是常用于實(shí)驗(yàn)小量蛋白復(fù)性研究的兩種方法。5.包涵體蛋白的色譜法體外折疊復(fù)性用變性緩沖液將難溶的包涵體溶解后,可根據(jù)重組蛋白分子大小、等電點(diǎn)、疏水性、溶解度和與其他物質(zhì)的親和性等特征,選擇合適的方法進(jìn)行進(jìn)一步純化和體外折疊復(fù)性。用于包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性的方法有稀釋、透析、超濾、色譜、高壓等。近年來發(fā)展起來的色譜法已成為基因重組蛋白質(zhì)復(fù)性的重要手段[28]。用色譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性可以有效地防止變性蛋白分子聚集,提高蛋白質(zhì)的活性回收率。更大的優(yōu)勢(shì)是實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)在復(fù)性的同時(shí)得到純化,打破了必須先純化再復(fù)性的限制,這是其他方法無可比擬的。用于蛋白質(zhì)復(fù)性的液相色譜法主要包括尺寸排阻色譜(sizeexclusionchromatography,SEC、)親和色譜(affinitychromatography,AFC)、離子交換色譜(ion-exchangechromatography,IEC)、疏水相互作用色譜(hydophobicinteractionchromatography,HIC)和擴(kuò)張床吸附色譜(expandedbedadsorptionchromatography,EBA等。5．小分子添加劑在蛋白體外復(fù)性中的作用如上所述,各類的體外輔助蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)都能不同程度地促使蛋白質(zhì)復(fù)性,但是蛋白質(zhì)復(fù)性效率的提高仍然是個(gè)難點(diǎn)。當(dāng)?shù)鞍自隗w外復(fù)性時(shí),蛋自質(zhì)復(fù)性效率實(shí)際上取決于正確折疊過程與聚集過程之間的競(jìng)爭(zhēng),即天然活性蛋白質(zhì)形成與聚集體的形成之間的競(jìng)爭(zhēng)。聚集體的形成常常被認(rèn)為是有一個(gè)“熔球態(tài)”的中間態(tài),它的形成是由于疏水基團(tuán)的暴露,使其自身容易發(fā)生聚集的結(jié)果。為此發(fā)展一些不同添加劑復(fù)性的方法,可以通過添加些小分了促進(jìn)劑來輔助蛋白折疊,抑制聚集體的形成。其主要以促進(jìn)蛋白折疊過程中正確的天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、促進(jìn)折疊中間產(chǎn)物的溶解性以及減少錯(cuò)誤折疊，增加復(fù)性蛋白的穩(wěn)定性為目的。小分子添加劑有以下6類:①表面活性劑或去垢劑:早期用3-(3-膽胺丙基)二甲氨基-1-丙磺酸、Tritionx-100、磷脂、脫氧膽酸鈉等一類小分子作為添加劑。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,這類小分子試劑在一定程度上可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊,但是有一個(gè)非常難以克服的困難是這些試劑難以除去。助溶劑:聚乙醇系列(PEG6000—200)。添加此類小分子,可以和蛋折疊中間產(chǎn)物特異結(jié)合,形成非聚集形式的化合物,同時(shí)這些化合物的存在大大少減少了蛋白分子之間的結(jié)合機(jī)會(huì),從而更進(jìn)一步的減少蛋自聚集形式的形成。6.親和色譜(AFC)親和色譜是基于固定相的配基與生物大分子之間生物親和能力的不同來進(jìn)行生物大分子相互間分離的方式。金屬螯合色譜是近年來發(fā)展起來的一種通用型配體親和技術(shù),它將金屬離子Cu2+、Zn2+、Ni2+等結(jié)合到固定相上，這些離子可與組氨酸、半胱氨酸形成配位鍵,因此含有這些氨基酸的蛋白質(zhì)將吸附到親和色譜的固定相上。目前在重組蛋白研究中應(yīng)用比較普遍的是在目的蛋白的N-端或C-端增加6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽,在高濃度變性劑存在的情況下,組氨酸仍可吸附在金屬親和介質(zhì)上,所以可直接在柱上進(jìn)行復(fù)性與純化。Ito等[33]采用IMAC對(duì)E.coli表達(dá)的(His)6-LECT2進(jìn)行了復(fù)性，以Ni-NTA為固定相降低脲濃度-向溶液中加入GSH/GSSG使二硫鍵交換-空氣中將巰基完全氧化的三步復(fù)性方法,使單體的濃度增加到81%。Yin等［34］以重組牛朊病毒的八肽重復(fù)序列為天然的親和標(biāo)簽,采用Ni-NTAIMAC柱對(duì)重組牛朊病毒進(jìn)行了柱上復(fù)性，得到了結(jié)構(gòu)正確的目標(biāo)蛋白，其質(zhì)量回收率為11%°Lemercier等［35］用IMAC對(duì)外用聚磷酸酶進(jìn)行了復(fù)性,并研究了不同變性劑去除速率對(duì)其復(fù)性的影響。Al-Samarrai等［16］利用IMAC對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)錄因子RGL3包涵體進(jìn)行了成功復(fù)性。7.離子交換色譜變性蛋白質(zhì)與離子交換介質(zhì)有分子間的電荷作用,從而被吸附到固定相表面,在洗脫除去變性劑時(shí)蛋白質(zhì)進(jìn)行吸附-解吸附-再吸附的復(fù)性。劉紅妮等［36］采用弱陽離子交換色譜法對(duì)溶菌酶進(jìn)行了復(fù)性,并詳細(xì)研究了多種因素對(duì)復(fù)性的影響。Langenhof等［37］采用強(qiáng)陰離子交換色譜對(duì)含17對(duì)二硫鍵的變性牛血清白蛋白進(jìn)行了復(fù)性,并證實(shí)延長(zhǎng)進(jìn)樣后放置時(shí)間可提高回收率。Machold等［38］研究了離子交換色譜填料種類、柱幾何形狀和進(jìn)樣量等對(duì)A-乳白蛋白的復(fù)性影響，并采用兩種不同的色譜復(fù)性模式對(duì)A-乳白蛋白進(jìn)行了復(fù)性:一種是將變性蛋白洗脫下來后,向其中加入氧化/還原試劑對(duì),使其完全復(fù)性;另一種是在流動(dòng)相中加入氧化/還原試劑對(duì),在洗脫過程中完成復(fù)性。Lu等［39］用弱陰離子交換色譜法,以DEAESepharoseFF為固定相，對(duì)重組雙重人干細(xì)胞因子（rdhSCF）進(jìn)行了復(fù)性并同時(shí)純化，所得復(fù)性率為19.46%,純度為90%。Machold等［20］利用離子交換色譜有效分離了重折疊的A-乳清蛋白與聚集蛋白。并將離子交換色譜和超濾、稀釋操作相結(jié)合，對(duì)緊密聚集的A-乳清蛋白進(jìn)行循環(huán)收集復(fù)性,產(chǎn)率可從25%提高到30%。8.疏水相互作用色譜(HIC)疏水色譜是在不帶電荷的載體上偶聯(lián)疏水基團(tuán),不同蛋白質(zhì)的疏水區(qū)與這些疏水基團(tuán)作用,從而將蛋白質(zhì)分離的一種色譜技術(shù)。變性蛋白表面的疏水氨基酸殘基有與疏水色譜固定相顆粒相互作用的傾向,二者之間的疏水相互作用能夠抑制變性蛋白分子間的相互聚集,同時(shí)疏水色譜固定相還能在分子水平上給變性蛋白分子提供高的能量,使其瞬時(shí)脫水并折疊成天然構(gòu)象或不同的折疊中間體。疏水色譜柱形成局部疏水環(huán)境以利于蛋白質(zhì)分子形成疏水核,并由此開始折疊復(fù)性。耿信篤等［40］利用自己設(shè)計(jì)的疏水色譜柱對(duì)重組人干擾素-C進(jìn)行純化和柱上復(fù)性,所得純度大于95%,比活大于107U/mg。參考文獻(xiàn)[1]LilieH,SchwarzE,RudolphR.AdvancesinrefoldingofproteinsproducedinE.coli.CurrentOpinioninBiotechnology,1998,9(5):497~501[2]SinghS,PandaA.Solubilizationandrefoldingofbacterialinclusionbodyproteins.Journalofbioscienceandbioengineering,2005,99(4):303~310[3]龔平生,羅貴民.包涵體復(fù)性研究進(jìn)展(英文).中國生物工程雜志,2003,23(12):73~77[4]方敏,黃華樑.包涵體蛋白體外復(fù)性的研究進(jìn)展.生物工程學(xué)報(bào),2001,17(6):608~612[5]RinasU,BaileyJ.ProteincompositionalanalysisofinclusionbodiesproducedinrecombinantEscherichiacoli.Appliedmicrobiologyandbiotechnology,1992,37(5):609~614[6]CarrioM,VillaverdeA.Constructionanddeconstructionofbacterialinclusionbodies.JournalofBiotechnology,2002,96(1):3~12[7]KaneJ,HartleyD.FormationofrecombinantproteininclusionbodiesinEscherichiacoli.Trendsinbiotechnology,1988,6:95~101[8]JungbauerA,KaarW.Currentstatusoftechnicalproteinrefolding.JournalofBiotechnology,2007,128(3):587~596[9]ClarkE.Proteinrefoldingforindustrialprocesses.CurrentOpinioninBiotechnology,2001,12(2):202~207[10]Haase-PettingellC,KingJ.FormationofaggregatesfromathermolabileinvivofoldingintermediateinP22tailspikematuration.Amodelforinclusionbodyformation.JournalofBiologicalChemistry,1988,263(10):4977~4983[11]FinkA.Proteinaggregation:foldingaggregates,inclusionbodiesandamyloid.Foldinganddesign,1998,3(1):9~23[12]TaylorG,HoareM,GrayD,eta.lSizeanddensityofproteininclusionbodies.NatureBiotechnology,1986,4(6):553~557[13]GuZ,WeidenhauptM,IvanovaN,eta.lChromatographicmethodsfortheisolationo,fandrefoldingofproteinsfrom,Escherichiacoliinclusionbodies.Proteinexpressionandpurification,2002,25(1):174~179[14]BatasB,SchiraldiC,ChaudhuriJ.Inclusionbodypurificationandproteinrefoldingusingmicrofiltrationandsizeexclusionchromatography.JournalofBiotechnology,1999,68(2-3):149~158[15]LinG,LianY,RyuJ,eta.lExpressionandpurificationofHis-taggedflavonolsynthaseofCamelliasinensisfromEscherichiacoli.Proteinexpressionandpurification,2007,55(2):287~292[16]Al-SamarraiT,KirkC,JonesW,eta.lExpressioninEscherichiacoliandinvitrorefoldingoftheplanttranscriptionfactorArabidopsisthalianaRGL3.Proteinexpressionandpurification,2007,53(2):289~292[17]WhiteC,ChenQ,KenyonG,eta.lAnovelactivityofOmpT.JournalofBiologicalChemistry,1995,270(22):12990~12994[18]GavitP,BetterM.ProductionofantifungalrecombinantpeptidesinEscherichiacoli.JournalofBiotechnology,2000,79(2):127~136[19]SchleglR,IbererG,MacholdC,eta.lContinuousmatrix-assistedrefoldingofproteins.JournalofChromatographyA,2003,1009:119~132[20]MacholdC,SchleglR,BuchingerW,eta.lContinuousmatrixassistedrefoldingofA-lactalbuminbyionexchangechromatographywithrecyclingofaggregatescombinedwithultradiafiltration.JournalofChromatographyA,2005,1080(1):29~42[21]RehG,SpelziniD,Tub口oG,eta.lPartitionfeaturesandrenaturationenhancementofchymosininaqueoustwo-phasesystems.JournalofChromatographyB,2007,860(1):98~105[22]ChoT,AhnS,LeeE.RefoldingofproteininclusionbodiesdirectlyfromE.colihomogenateusingexpandedbedadsorptionchromatography.Bioseparation,2001,10(4):189~196[23]SharmaK,BabuP,SasidharP,eta.lRecombinanthumanepidermalgrowthfactorinclusionbodysolubilizationandrefoldingatlargescaleusingexpanded-bedadsorptionchromatographyfromEscherichiacoli.Proteinexpre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