免疫標(biāo)記技術(shù)第二十四章濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室王麗娜工號：11075Tel：8462530E-mail：myx@目的要求掌握免疫標(biāo)記技術(shù)的原理掌握免疫標(biāo)記技術(shù)的種類、原理及用途熟悉蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的原理及用途免疫標(biāo)記技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)

免疫標(biāo)記技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)和標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，將已知的抗體或抗原標(biāo)記上示蹤物質(zhì)，通過檢測標(biāo)記物，間接測定抗原-抗體復(fù)合物的一類方法。PartI免疫標(biāo)記技術(shù)

優(yōu)點：特異、敏感、精確、快速、可定性、定量甚至定位，操作簡便，易于商品化和自動化。常用標(biāo)記物：熒光素（異硫氰酸熒光素、羅丹明）酶（辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）放射性同位素（125I）生物素、鐵蛋白、膠體金、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)免疫熒光技術(shù)酶免疫技術(shù)放射免疫測定法發(fā)光免疫測定法免疫標(biāo)記技術(shù)一、免疫酶測定法（enzymeimmunoassayEIA)酶免疫測定法是一種用酶標(biāo)記一抗或二抗檢測特異性抗原或抗體的方法。常用的酶：辣根過氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AP）常用的酶的底物（1）辣根過氧化物酶（HRP）常用底物：鄰苯二胺（OPD）：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性。四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：反應(yīng)后呈藍(lán)色，無需避光，無致癌性，但水溶性差。（2）堿性磷酸酶（AP）對硝基苯磷酸酯（p-NPP），產(chǎn)物為黃色。酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassayELISA）：檢測可溶性抗原，可定性、定量，不能定位酶免疫組化（IHC）：檢測組織和細(xì)胞中的抗原，可定性、定位，不能定量常用的方法：(一)酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay，ELISA)概念用酶標(biāo)記抗原或抗體，將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效催化作用有機結(jié)合的技術(shù)?？擅舾械臋z測體液中微量的特異性抗體或抗原?？啥ㄐ?、定量、不能定位原理使Ag或Ab結(jié)合到某種固相載體表面，保持其免疫活性。用酶標(biāo)記Ag或Ab，同時保留免疫活性和酶活性。將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)物質(zhì)按不同步驟與固相載體表面物質(zhì)反應(yīng)，洗滌游離物質(zhì)。酶將底物催化，顯色深淺與受檢Ag或Ab的量成正比。借助顏色反應(yīng)的深淺來定性、定量Ag或Ab。比色比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。用特定的波長測讀吸光值。

比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度(opticaldensity,OD),現(xiàn)按規(guī)定用吸光度(absorbence,A),兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為490nm，表示方法為"A490nm"或"OD490nm"。EquipmentforperformingtheELISAtestPipettesIncubatorELISAreader

特點敏感性高、特異性強、操作簡單、結(jié)果易觀察常用方法：

1.雙抗體夾心法：最常用來檢測抗原

2.間接法：最常用來檢測抗體

3.BAS-ELISA:提高實驗敏感性1)雙抗體夾心法包被抗體加待檢抗原加酶標(biāo)二抗加酶的底物洗滌洗滌洗滌todetectAg

2)間接ELISA包被抗原洗滌洗滌洗滌加酶的底物加待檢抗體加酶標(biāo)二抗3)BAS-ELISA(biotin-avidinsystem,BAS-ELISA)這是在ELISA中引入一個放大系統(tǒng)。生物素（biotin）是廣泛存在于生物組織中的一種生長因子，可以標(biāo)記抗體和酶而不影響其活性。親和素（avidin）是從卵白中提取的一種蛋白質(zhì)，也可從鏈霉菌培養(yǎng)濾液中提取鏈霉親和素(streptavidin)。一個親和素分子可結(jié)合4個生物素分子。一個Ig分子可偶聯(lián)90個生物素分子。一抗二抗（生物素化）SABC（標(biāo)有AP）底物-AP-APAP-3)BAS-ELISA(biotin-avidinsystem,BAS-ELISA)BAS的優(yōu)點：BAS-ELISA比標(biāo)準(zhǔn)ELISA的敏感性大大提高。BAS的缺點：親和素是PI較高的糖蛋白，對聚苯乙烯、硝酸纖維素膜、DNA有較高的非特異吸附，在ELISA、免疫組化、DNA雜交等檢測中應(yīng)用出現(xiàn)較高的背景著色。

5）斑點ELISA(dot-ELISA)優(yōu)點：靈敏度較一般ELISA高6～8倍、可達(dá)ng水平。試劑用量小，不需其它設(shè)備條件。（二）免疫組化技術(shù)

是應(yīng)用標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進(jìn)行定位、定性、定量檢測的技術(shù)。特異性可見性間接SABC-AP法

T細(xì)胞亞群檢測

CD分子T細(xì)胞一抗（小鼠抗人CD3/CD4/CD8分子mAb）二抗（生物素化）SABC（標(biāo)有AP）底物-AP-APAP-小鼠肝癌石蠟切片免疫組化二、免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)(immunofluorescencetechnique)是免疫標(biāo)記技術(shù)中發(fā)展最早的一種。是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測的敏感性和直觀性結(jié)合起來的一種方法。熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學(xué)方式共價結(jié)合而成。常用于標(biāo)記的熒光素：異硫氰酸熒光黃（FITC）--黃綠色熒光四乙基羅丹明（RB200）--明亮橙色熒光四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）--橙紅色熒光。標(biāo)記方法：攪拌法(適合大樣品)

透析法(適合小樣品)標(biāo)記抗體的純化：透析法、層析分離法免疫熒光技術(shù)類型

1.直接法優(yōu)點：操作簡便、特異性高、非特異熒光染色因素少。缺點：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體。2.間接法優(yōu)點：靈敏度高，在不同抗原的檢測中只需應(yīng)用一種熒光抗體。既可檢測抗原，也可檢測抗體。缺點：是較易出現(xiàn)非特異性熒光。三、放射免疫測定放射免疫測定法（radioimmunoassay,RIA）是以放射性核素作為示蹤劑的免疫標(biāo)記測定方法，其特點是將核素分析的高靈敏度與抗原-抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合。常用的核素有兩大類γ射線：131I、125I、57Cr和60Coβ射線：14C、3H和32P。使用最廣泛的是：125I放射免疫測定缺點：使用特殊的儀器設(shè)備有放射性危害，需要一定的防護(hù)條件。優(yōu)點：能測出ng/ml（毫微克）甚至pg/ml（微微克）水平的微量物質(zhì)。樣品用量少，精確性好，操作易規(guī)范化和自動化。四、發(fā)光免疫分析(luminescenceimmunoassay,LIA)

發(fā)光免疫技術(shù)是將發(fā)光分析系統(tǒng)和免疫測定相結(jié)合而建立的一種新的超微量免疫分析技術(shù)。該方法既具有免疫反應(yīng)的高度特異性又有發(fā)光分析的高靈敏度。發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后

夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）直接化學(xué)發(fā)光的機理根據(jù)發(fā)光免疫技術(shù)中發(fā)光標(biāo)記物不同，分為四種類型?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmuneassay，CLIA)生物發(fā)光免疫測定(bioluminescenceimmunoassay,BLIA)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(luminescenceenzymeimmunoassay，IEIA)電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA）1)化學(xué)發(fā)光免疫測定（CLIA）用吖啶酯直接標(biāo)記抗體，與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出待測抗原的含量。2)生物發(fā)光免疫測定（BLIA）利用生物發(fā)光物質(zhì)（如螢火蟲或發(fā)光水母）或參與生物發(fā)光反應(yīng)的輔助因子（如ATP或NAD）等對活細(xì)胞進(jìn)行多種生物學(xué)功能檢測，例如通過熒光素酶報告基因檢測細(xì)胞凋亡或檢測細(xì)胞增殖。3)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescenceenzyme

immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如HRP或AP來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。4)電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。五、免疫膠體金技術(shù)（ICS）氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。用膠體金顆粒標(biāo)記抗體或抗原，以檢測未知抗原或抗體的方法應(yīng)用:快速診斷膠體金標(biāo)記技術(shù)的類型

（一）斑點金免疫滲濾試驗

斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunogoldfiltrationassay，DIGFA)是以NC膜為載體，包被抗原或抗體于滲濾裝置中，依次滴加標(biāo)本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜貼置于吸水材料上故溶液流經(jīng)滲濾裝置時與膜上的抗原或抗體快速結(jié)合并起到濃縮作用，達(dá)到快速檢測目的(一般5min左右完成)。膠體金標(biāo)記技術(shù)的類型

（二）斑點免疫層析試驗原理斑點免疫層析試驗（dot-immunochromatographicassay，DICA）簡稱免疫層析試驗（ICA），也以NC膜為載體，但利用了微孔膜的毛細(xì)管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析一般。在移動過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判斷實驗結(jié)果。尿樣陽性弱陽性陰性無效質(zhì)控線測試線舉例：如早孕反應(yīng)試紙條原理吸水墊料C區(qū)抗鼠IgGT區(qū)鼠抗HCG抗體金標(biāo)抗HCG抗體吸水墊料樣品流向陽性C區(qū)T區(qū)亦被稱為westernblotting，免疫印跡法是將電泳與ELISA結(jié)合起來的一種方法分三個階段進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）電轉(zhuǎn)移酶免疫定位免疫印跡法結(jié)合了電泳的高分辨率和酶免疫測定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣品組分的免疫學(xué)測定方法。六、免疫印跡技術(shù)（immunoblottingtest，IBT）PartII蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片（proteinchip）,又稱蛋白質(zhì)微陣列，是指固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列。利用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、酶與底物、蛋白質(zhì)與其他小分子間的相互作用，分析檢查蛋白質(zhì)的一項技術(shù)。可以實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高通量的檢查。用途蛋白質(zhì)芯片是一種高通量的蛋白功能分析技術(shù)，可用于：蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用DNA－蛋白質(zhì)、RNA－蛋白質(zhì)的相互作用生化反應(yīng)的檢測疾病診斷篩選藥物作用的蛋白靶點等。特點高度并行性：提高實驗進(jìn)程、利于顯示圖譜的快速對照和閱讀。多樣性：可進(jìn)行樣品的多方面分析，提高精確性，減少誤差。微型化：減少試劑用量和反應(yīng)液體積，提高樣品濃度和反應(yīng)速率。自動化：降低成本，保證質(zhì)量。優(yōu)點1.直接用粗生物樣品進(jìn)行分析2.小量樣品3.高通量的驗證能力4.發(fā)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)5.測定疏水蛋白質(zhì)6.在同一系統(tǒng)中集發(fā)現(xiàn)和檢測為一體，特異性高利用單克隆抗體芯片，可鑒定未知抗原/蛋白質(zhì)，以減少測定蛋白質(zhì)序列的工作量。面臨挑戰(zhàn)⑴建立快速、廉價、高通量的蛋白質(zhì)表