基本要求

一、掌握定量分析方法驗(yàn)證的效能指標(biāo)。二、熟悉定量分析樣品的前處理方法。三、了解定量分析樣品的前處理方法的進(jìn)展及在藥物分中的應(yīng)用。第一頁，共50頁。

第四章藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證定量分析樣品前處理方法

定量分析方法特點(diǎn)

藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證123第二頁，共50頁。一、定量分析樣品前處理方法

Pretreatmentofsampleusedinquantitativeanalysis定量分析樣品前處理方法

概述12第三頁，共50頁。定量分析樣品前處理方法直接測定法－含金屬或C-M不牢固的有機(jī)金屬經(jīng)水解后測定法－鹵素聯(lián)脂肪碳鏈（溶于適當(dāng)溶劑再水解）直接回流后測定 堿化回流后測定硫酸水解后測定經(jīng)氧化還原后測定法－鹵素聯(lián)芳環(huán)牢固（一般用于測碘）堿性還原后測定法－如泛影酸利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法:第四頁，共50頁。（一）直接測定法例如：富馬酸亞鐵

溶于熱稀礦酸，采用鈰量法，鄰二氮菲作指示劑鄰二氮菲與亞鐵離子的配合物顯紅色，化學(xué)計(jì)量點(diǎn)后，指示劑中的Fe2+→Fe3+，生成鄰二氮菲鐵，顯淡藍(lán)色指示終點(diǎn)。

2FeS04+2Ce（S04）2→Fe2（S04）3+Ce2（S04）3第五頁，共50頁。（二）經(jīng)水解后測定法

1.堿水解后測定法例如：三氯叔丁醇的含量測定

CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl+AgNO3AgCl+NaNO3AgNO3+NH4SCNAgSCN+NH4NO3

2.酸水解后測定法例如：硬脂酸鎂的含量測定

Mg(C17H35COO)2+H2SO4

MgSO4+2C17H35COOH

H2SO4+2NaOHNa2SO4

+2H2O

△第六頁，共50頁。（三）經(jīng)氧化還原后測定法堿性還原后測定例如：泛影酸的含量測定

堿性條件下Zn還原，生成無機(jī)碘化物，用銀量法測定

第七頁，共50頁。

濕法破壞

藥物分析中常用的有機(jī)破壞的方法有干法破壞

HNO3-HClO4法氧瓶燃燒法(一)濕法破壞HNO3-H2SO4法H2SO4-硫酸鹽法

HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2；H2SO4-KMnO4(二)干法破壞高溫灼燒：加Na2CO3或ZnO以助灰化；溫度控制在420℃

經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法凱氏定氮法第八頁，共50頁?？招腁.燃燒瓶B.鉑絲網(wǎng)C.D.盛固體樣品濾紙及其折疊法E.F.G.稱取液體樣品方法7mm50mm30mm尾部7mm13mm20mm25mm356mm166mm濾紙濾紙AGFEDCB氧瓶燃燒裝置及稱樣方法第九頁，共50頁。氧瓶燃燒法

樣品吸收液

測定方法含氟有機(jī)藥物H2O

pH4.3HAc-NaAc

Buffer茜素氟藍(lán)

分光光度法含氯有機(jī)藥物NaOH溶液

銀量法汞量法

分光法含溴有機(jī)藥物H2O2-NaOH液

或NaOH液-

銀量法分光法

硫酸肼飽和液含碘有機(jī)藥物NaOH液-銀量法碘量法硫酸肼飽和液

汞量法分光法第十頁，共50頁。碘苯酯含量測定

取本品約20mg，精密稱定，照氧瓶燃燒法進(jìn)行有機(jī)破壞，用NaOHT.S.2ml與H2O10ml為吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液10ml，密塞，振搖放置數(shù)分鐘，加甲酸約1ml，用水洗滌瓶口，并通入空氣流約3~5min，以除去剩余的溴蒸氣，加KI2g，密塞，搖勻，用Na2S2O3液(0.02mol/L)滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml的硫代硫酸鈉液(0.02mol/L)相當(dāng)于1.388mg的C19H29IO2第十一頁，共50頁。定量分析方法特點(diǎn)

一、容量分析法（一）容量分析法的特點(diǎn)

操作簡單、快速；比較準(zhǔn)確（RSD＜0.2%）；儀器普通易得。第十二頁，共50頁。（二）容量分析法的計(jì)算問題

1.滴定度（T）的概念每1ml溶液相當(dāng)于被測物質(zhì)的量(mg)2.滴定度的計(jì)算aA+bBcC+dD

T=M×a/b×m

3.百分含量的計(jì)算（1）直接滴定法D%=V×F×T/W×100%

F=實(shí)際標(biāo)定的濃度/規(guī)定的濃度

（2）間接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）

D%=（VO

–

VB)×F×T/W×100%第十三頁，共50頁。

二、光譜分析法

（一）紫外-可見分光光度法（200nm～760nm)靈敏度高，可達(dá)10-4g/ml～10-7g/ml1.特點(diǎn)準(zhǔn)確度高，SRD（%）為2%～5%儀器價(jià)格低廉，操作簡單，易普及，應(yīng)用范圍廣。2.朗伯-比耳定律A=ECLE1%1cm=ε×10/M第十四頁，共50頁。

3.儀器校正和檢定

波長校正用汞燈中較強(qiáng)譜線237.38,253.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm與576.96nm

或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm進(jìn)行校正。吸收度的檢定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml

波長(nm)235(最小)257(最大)313(最小)350(最大)

E1%1cm124.5144.048.62106.6

雜散光檢查：試劑濃度(g/ml)測定波長透光率(%)

NaI1.00220nm＜0.8NaNO25.00340nm＜0.8第十五頁，共50頁。4.對溶劑的要求:220～240nm241～250nm251～300nm300nm以上溶劑+吸收池A＜0.41＜0.20＜0.10＜0.05

5.測定方法：要求供試品溶液的A應(yīng)在0.3～0.7

標(biāo)準(zhǔn)曲線法常用方法：對照品比較法：Cx=(Ax/Ar)Cr;含量%=Cx×D/W×100%吸收系數(shù)法：含量%=(E1%1cm

)x/(E1%1cm

)r×100%

計(jì)算分光光度法：VA的三點(diǎn)校正法第十六頁，共50頁。（二）熒光分光光度法

靈敏度高，可達(dá)10-10g/ml～10-12g/ml

在低濃度進(jìn)行測定，防止F與C不成正比及自熄滅作用1.特點(diǎn)用基準(zhǔn)物溶液校正儀器靈敏度，防止樣品液熒光衰減靈敏度高，但干擾因素多。

制備熒光衍生物，可提高其靈敏度和選擇性。用樣品量少，操作簡單，方法快速，應(yīng)用范圍較廣。

第十七頁，共50頁。2.熒光分析儀有二個(gè)單色光器—激發(fā)單色光器與發(fā)射單色光器；且激發(fā)光源、樣品池和檢測器成直角。3.含量測定常用的方法對照品比較法:Ci=(Ri-Rib)/(Rr-Rrb)×Cr

Ch.P收載地高辛片、利血平片、洋地黃毒苷片。第十八頁，共50頁。

三、色譜分析法

按分離原理分為：吸附；分配；離子交換；排阻色譜方法分類按分離方法分為：PC；TLC；柱色譜；GC；HPLC。

（一）HPLC法1.對HPLC儀器一般要求色譜柱、流動相按品種項(xiàng)下要求。色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)22.系統(tǒng)性試驗(yàn)分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1

應(yīng)在0.9～1.05

第十九頁，共50頁。內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量3.測定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法

外標(biāo)法測定供試品中主成分含量外標(biāo)一點(diǎn)法應(yīng)用示例：RP-HPLC法測定鹽酸黃酮哌酯片含量，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法如頭孢拉丁；頭孢羥氨芐；頭孢唑啉鈉用外標(biāo)一點(diǎn)法第二十頁，共50頁。

（二）GC法1.對GC儀器一般要求載氣為氮?dú)猓簧V柱為填充或毛細(xì)管柱色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)22.系統(tǒng)性試驗(yàn)分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1

應(yīng)在0.9～1.05第二十一頁，共50頁。內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量

3.測定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法

外標(biāo)法測定供試品中主成分含量外標(biāo)一點(diǎn)法應(yīng)用示例：Ch.P(2000)收載的月桂卓酮、維生素E及其片劑、注射劑、甲酚皂溶液等均采用GC法中的內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定含量。第二十二頁，共50頁。藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證

指導(dǎo)原則藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則緩釋、控釋制劑指導(dǎo)原則微囊、微球與脂質(zhì)體制劑指導(dǎo)原則細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則第二十三頁，共50頁。藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證

目的：

證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測要求

效能指標(biāo)：評價(jià)分析方法的尺度

效能指標(biāo)包括:

精密度,準(zhǔn)確度,檢測限,定量限,選擇性,

線性與范圍,耐用性第二十四頁，共50頁。(1)準(zhǔn)確度（accuracy）：測量值與真實(shí)值接近的程度表示:回收率測定方法：回收試驗(yàn)加樣回收試驗(yàn)第二十五頁，共50頁。1.原料藥可用已知純度對照品或樣品進(jìn)行測定；或與已建準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。2.制劑要考察輔料對回收率的影響。采用在空白輔料中加入原料對照品的方法作回收率試驗(yàn)，然后計(jì)算RSD。

具體做法：測定高、中、低三個(gè)濃度，n=3,共9個(gè)數(shù)據(jù)來評價(jià)回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC法時(shí)，一般回收率可達(dá)98%～102%；容量法可達(dá)99.7%～100.3%

第二十六頁，共50頁?；厥章?=（測定平均值—空白值）/加入量×100%要求制備高、中、低三濃度的樣品，各測定3次。應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率，或測定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其可信限。第二十七頁，共50頁。(2)精密度（precision）：定義:

同一樣品多次測量值之間相互接近的程度表示：標(biāo)準(zhǔn)偏差(s),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)重復(fù)性:同一實(shí)驗(yàn)室,同一人多次測定的精密度中間精密度:同一實(shí)驗(yàn)室，不同人，不同儀器測定的精密度重現(xiàn)性:不同實(shí)驗(yàn)室，不同人測定的精密度第二十八頁，共50頁。(3)專屬性（specificity）:

指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。第二十九頁，共50頁。含量測定和雜質(zhì)測定:

色譜法和其他分離法，應(yīng)附代表性的圖譜，以說明專屬性。圖中應(yīng)注明各組分的位置，色譜法中分離度應(yīng)符合要求。在能獲得雜質(zhì)的情況下，可加到試樣中，考察對結(jié)果的干擾。在雜質(zhì)和降解物不能獲得的情況下，可用以驗(yàn)證方法和藥典方法進(jìn)行對照；也可用對試樣加速破壞的方法，比較兩種方法。鑒別反應(yīng):應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測組分的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。第三十頁，共50頁。(4)檢測限（limitofdetection，LOD）：藥物能被檢出的最低濃度(μg/ml)

測定:信噪比法(S:N=3:1)(5)定量限（1imitofquantitation，LOQ）：藥物能被定量測出的最低濃度(μg/ml)

測定:信噪比法(S:N=10:1)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證

------------性能指標(biāo)第三十一頁，共50頁。(6)線性與范圍（linearityandrange）：待測物濃度與響應(yīng)值成線性關(guān)系的濃度范圍線性關(guān)系：Y=a+bx（r=0.9999)

線性程度：相關(guān)系數(shù)(7)耐用性（robustness）:

測定條件稍有變動時(shí)，對測定結(jié)果的影響程度影響因素：被測溶液的穩(wěn)定性，流動相的組成和pH，商品柱的品牌，柱溫等藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證

------------性能指標(biāo)第三十二頁，共50頁。檢驗(yàn)項(xiàng)目和驗(yàn)證內(nèi)容：項(xiàng)目內(nèi)容鑒別雜質(zhì)測定含量測定及溶出量測定定量限度準(zhǔn)確度＋＋精密度－＋重復(fù)性＋＋中間精密度

＋①

＋①

專屬性②＋＋＋＋檢測限

－③＋－定量限＋－線性＋＋范圍＋＋耐用性＋＋＋①已有重現(xiàn)性驗(yàn)證，不需驗(yàn)證中間精密度②如一種方法不夠?qū)?，可用其他分析方法予以補(bǔ)充③視具體情況予以驗(yàn)證第三十三頁，共50頁。生物樣品分析的基本步驟1.藥物從蛋白結(jié)合或綴合物中釋出⑴蛋白變性：如應(yīng)用三氯醋酸、HClO4、有機(jī)溶劑(乙醇、丙酮、乙腈)使蛋白沉淀⑵鹽酸水解⑶酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素(一種細(xì)菌性蛋白分解酶，可在pH7.0~11.0使肽鍵降解)第三十四頁，共50頁。第三十五頁，共50頁。定量分析方法的驗(yàn)證

----------生物樣品分析（一）特異性 內(nèi)源性物質(zhì)不得干擾原藥、代謝物（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線

r≥0.9900，至少5個(gè)濃度，不許外延（三）精密度和準(zhǔn)確度

RSD≤15％、20％ 相對回收率85～115％（80～120％）第三十六頁，共50頁。（四）最低定量限LOQ 3~5倍t1/2，或1/10～1/20倍Cmax（五）樣品穩(wěn)定性 室溫、凍融、冰凍長期（六）提取回收率（絕對回收率） 一般低于100％，須穩(wěn)定（七）質(zhì)控樣品 已知濃度樣品均勻放入待測生物樣品序列中，以確保定量測定的準(zhǔn)確度定量分析方法的驗(yàn)證

----------生物樣品分析第三十七頁，共50頁。樣品固相凈化

及反相高效液相色譜法

測定血漿中茶堿伍朝筼等藥學(xué)學(xué)報(bào),1989,24(10):769~773第三十八頁，共50頁。血漿樣品凈化后空白血漿凈化前空白血漿ColumnZorbaxC185μm2.5cm4.6mm254nmPrecolumnYWG-ODS9-11μm54.6mmMobilePhase:甲醇-醋酸鈉(0.05mol/LpH3.0)50?5012840min茶堿咖啡因12840min12840min第三十九頁，共50頁。50100150200252015105茶堿(μg/ml)(min)·······················五例病人血漿茶堿濃度測定6.412.819.225.63232.41.81.20.60茶堿(μg/ml)·····標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=9.56610-2X+6.15310-3

r=0.9995第四十頁，共50頁。練習(xí)與思考[A型題]

1．藥品的鑒別是證明A．未知藥物的真?zhèn)蜝．已知藥物的真?zhèn)蜟．已知藥物的療效D．藥物的純度E．藥物的穩(wěn)定性2．相對標(biāo)準(zhǔn)差表示的應(yīng)是A．準(zhǔn)確度B．回收率C．精密度D．純凈度E．限度第四十一頁，共50頁。3．用移液管量取的25ml溶液，應(yīng)記成A．25mlB．25.0mlC．25.00mlD．25.000mlE．25±1ml4．以下三個(gè)數(shù)字0.5362、0.0014、0.25之和應(yīng)為A．0.79B．0.788C．0.787D．0.7876E．0.8第四十二頁，共50頁。5．表示兩變量指標(biāo)A與C之間線性相關(guān)程度常用A．相關(guān)規(guī)律B．比例常數(shù)C．相關(guān)常數(shù)D．相關(guān)系數(shù)E．精密度6．減小偶然誤差的方法是A．做空白試驗(yàn)B．做對照實(shí)驗(yàn)C．做回收試驗(yàn)D．增加平行測定次數(shù)E．選用多種測定方法第四十三頁，共5