LungCancerinSolidTumorinChina第一頁，共60頁。=？液態(tài)活檢通過外周血中的腫瘤細(xì)胞或者腫瘤基因組信息來評估腫瘤病理活檢通過原發(fā)灶腫瘤組織來評估腫瘤CTCctDNA

mircoRNALNCRNAOthers

傳統(tǒng)的組織細(xì)胞學(xué)檢測第二頁，共60頁。液態(tài)活檢在肺癌中的應(yīng)用治療策略事件肺癌待查輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復(fù)發(fā)監(jiān)測治療方案選擇療效評估耐藥機(jī)理新藥研發(fā)第三頁，共60頁。治療策略事件疑似肺癌輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復(fù)發(fā)監(jiān)測治療方案選擇耐藥機(jī)理新藥研發(fā)CTC的臨床應(yīng)用價(jià)值療效評估CTC(數(shù)量）(負(fù)向富集+靶向PCR）ctDNA(基因變異）第四頁，共60頁。1、K.Pantel,etal.NatRevClinOncol,2009;2、K.PantelandMR.Speicher,Oncogene2015什么是循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CirculatingTumorCell，CTC）？腫瘤釋放如外周血中CTCs數(shù)量的多少，可間接反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)CTC：在腫瘤發(fā)生過程中，具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞和不具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞，均由原發(fā)腫瘤脫落釋放入外周血，兩者統(tǒng)稱循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CirculatingTumorCell）CTC1CTC≠有轉(zhuǎn)移：侵入第二器官CTCs，稱之為DTC（disseminatedTumorCell），只有由具有干細(xì)胞特征的DTC所形成的微轉(zhuǎn)移灶，逃避免疫識別才可能發(fā)展成為腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移2第五頁，共60頁。第9周的乳腺管組織切片：乳腺管周圍非典型性增生第30周的腫瘤組織切片：新生的腫瘤上皮細(xì)胞形成牙槽并侵襲周圍基質(zhì)CK+cellsHER-2+cells什么時(shí)候可以檢測到CTC？早期腫瘤外周血中即可檢出CTC第六頁，共60頁。WHe,etal.ProcNatlAcadSci,2007早期腫瘤外周血中即可檢出CTC表達(dá)中等量FR的M109鼠肺癌細(xì)胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側(cè)面移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測到大約1.4個(gè)CTC細(xì)胞移植后第3和第4周，則每分鐘可分別檢測7個(gè)和18個(gè)CTC，隨著腫瘤逐漸增大數(shù)量呈指數(shù)上升在腫瘤移植的前4周內(nèi)，沒有在任何組織切片中發(fā)現(xiàn)到存在轉(zhuǎn)移性癌癥的跡象第七頁，共60頁。CTC富集技術(shù)密度與大小免疫磁珠（負(fù)向富集or陽性富集)微流體CTC

檢測方法CTC檢測技術(shù)靶向PCR免疫熒光普通PCR=+第八頁，共60頁?！胺椒ā薄笆斋@”“垃圾”蟹餌沒水了，我們躲不了了放水負(fù)向富集優(yōu)勢：回收率100%劣勢：純度略低正向富集優(yōu)勢：純度高劣勢：回收率低（漏掉CTC）幸好沒貪嘴，我們逃了第九頁，共60頁?！胺椒ā薄笆斋@”“垃圾”沒水了，我們躲不了了放水負(fù)向富集優(yōu)勢：回收率100%劣勢：純度略低大小富集（ISET）優(yōu)勢：簡單劣勢：漏掉小的CTC細(xì)胞幸好沒吃胖，我們逃了網(wǎng)篩第十頁，共60頁。CytoploRare?（FR靶向PCRCTC檢測技術(shù)）檢測原理負(fù)向富集靶向PCRFR陽性靶標(biāo)肺癌細(xì)胞FR(葉酸受體）高度表達(dá)CTC：FR=1:50萬EMT轉(zhuǎn)化不影響FR豐度其他血細(xì)胞不表達(dá)FRCTC回收率接近100%磁珠富集易操作和自動(dòng)化靈敏度超高，負(fù)向富集可滿足檢測要求信號二次放大，1個(gè)CTC信號放大10^12倍無需人工經(jīng)驗(yàn)判讀，結(jié)果客觀準(zhǔn)確可實(shí)現(xiàn)CTC的定量第十一頁，共60頁。CytoploRare?

FR靶向PCRCTC檢測

靶向PCR，信號放大，保證高度敏感性

1個(gè)CTC信號放大1012倍第十二頁，共60頁。優(yōu)勢一：陰性富集不丟失循環(huán)腫瘤細(xì)胞優(yōu)勢二：靶向探針特異性高優(yōu)勢三：PCR擴(kuò)增信號，確保高敏感性優(yōu)勢四：PCR儀判斷CTC技術(shù)，避免人為誤差第十三頁，共60頁。CytoploRare?敏感性特異性可重復(fù)性臨床應(yīng)用便捷性第十四頁，共60頁。CytoploRare?敏感性特異性可重復(fù)性臨床應(yīng)用便捷性第十五頁，共60頁。3mL血1mL/3mL血3mL血1個(gè)CTC/3mL血50萬FR/1個(gè)CTC1個(gè)CTC/1slide100萬信號/1個(gè)FR1個(gè)信號/1個(gè)CTCFR靶向PCR——1個(gè)CTC細(xì)胞信號方法10^12倍（萬億倍）細(xì)胞免疫熒光——1個(gè)CTC細(xì)胞信號幾乎沒有放大第十六頁，共60頁。CytoploRare?

FR靶向PCRCTC檢測

敏感性試驗(yàn)：1ctcin1,200,000白細(xì)胞JiataoLou,etal.PlosOne2013

將不同數(shù)量的FR陽性腫瘤細(xì)胞分別摻入3ml全血7）

FR靶向PCRCTC檢測技術(shù)的回收率接近100%，且呈線性分布檢測靈敏度約為5.09/（1.2~3*107）=1/240萬~600萬第十七頁，共60頁。摻入細(xì)胞數(shù)量(個(gè))檢出細(xì)胞數(shù)量(CU)

復(fù)管1復(fù)管2復(fù)管3檢測均值檢出細(xì)胞數(shù)(個(gè))回收率(%)平均回收率(%)R600571.52565.13586.37574.34584.1297.3598.750.9998400372.13372.99379.75374.96379.5994.90200198.93192.81185.90192.55192.4696.2310093.6696.7390.0893.4990.8490.845056.5652.0750.8053.1449.4498.892020.4324.5823.8722.9618.4892.401017.4817.1614.5616.4011.75117.5159.909.2610.589.915.09101.8705.005.444.404.950.00/

將不同數(shù)量的FR陽性腫瘤細(xì)胞分別摻入3ml全血7）檢測靈敏度約為5.09/（1.2~3*107）=1/240萬~600萬CytoploRare?

FR靶向PCRCTC檢測

敏感性試驗(yàn)：1ctcin6,000,000白細(xì)胞第十八頁，共60頁。CytoploRare?敏感性特異性可重復(fù)性臨床應(yīng)用便捷性第十九頁，共60頁。CytoploRare?

FR靶向PCRCTC檢測技術(shù)

FR（葉酸受體，高度特異性的靶向探針）

特異性高：加入FR靶向探針前，加入高濃度葉酸封閉細(xì)胞表面的葉酸受體，檢測結(jié)果為陰性

背景表達(dá)：去除FR靶向探針，僅保留特異性DNA片段，與保留FR靶向探針相比，檢測結(jié)果一致，提示背景可能為特異性DNA片段所致的固定值JiataoLou,etal.PlosOne2013第二十頁，共60頁。CellSearch:正向富集+免疫熒光技術(shù)進(jìn)行捕獲和鑒定21EpCAM–上皮細(xì)胞粘附分子APC–異藻藍(lán)蛋白熒光染料CK–細(xì)胞角蛋白PE–藻紅蛋白熒光染料DAPI–4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA熒光染料）上皮細(xì)胞白細(xì)胞抗EpCAM磁流體EpCAM抗原CD45抗原CK抗原抗CD45-APC染料抗CK-PE染料熒光染料第二十一頁，共60頁。EpCAM陰性細(xì)胞中，存在大量CTCCellResearch系統(tǒng)主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做為探針

研究證實(shí)，EpCAM陰性的細(xì)胞中也存在CTCJiataoLou,etal.PlosOne2013第二十二頁，共60頁。2004CellSearch:乳腺癌中檢測出，但肺癌敏感性低2011CellResearch:采用的抗體(EpCAM)對EMT細(xì)胞特異性差，而肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移入血需要EMT的過程第二十三頁，共60頁。有報(bào)道，部分激活的巨噬細(xì)胞存在FR的高表達(dá)1臨床前研究證實(shí)，這部分巨噬細(xì)胞很少在正常人的外周血中出現(xiàn)2使用抗CD14免疫磁珠去除巨噬細(xì)胞后，CTC的檢測結(jié)果無明顯改變31、HeW,etal.IntJCancer2008;2、HeW,etal.ProcNatlAcadSci,2007;3、JiataoLou,etal.PlosOne2013CytoploRare?

FR靶向PCRCTC檢測技術(shù)

巨噬細(xì)胞（可能存在FR表達(dá)）不影響檢測結(jié)果

第二十四頁，共60頁。CytoploRare?敏感性特異性可重復(fù)性臨床應(yīng)用便捷性第二十五頁，共60頁。CytoploRare?FR靶向PCRCTC檢測技術(shù)

同一患者重復(fù)檢測，可重復(fù)性高

第二十六頁，共60頁。CytoploRare?敏感性特異性可重復(fù)性臨床應(yīng)用便捷性第二十七頁，共60頁。第二十八頁，共60頁。3mL血→6個(gè)小時(shí)→得到報(bào)告檢測流程第二十九頁，共60頁。肺癌領(lǐng)域，CTC檢測技術(shù)對比CytoploRare?（格諾）CellSearch?CyttelTM（北京萊爾）CanpatrolTM（益善）CTC-Biopsy?（武漢友之友)核心技術(shù)免疫磁珠負(fù)向富集靶向配體PCR技術(shù)

流式正向富集技術(shù)熒光標(biāo)記免疫磁珠負(fù)向富集、Fish技術(shù)ISET（濾膜）原位雜交RNA分析ISET（濾膜)熒光標(biāo)記特異性88%80%83%75%70%靈敏度80%30%腺癌：46%30%30%自動(dòng)化半自動(dòng)全自動(dòng)半自動(dòng)半自動(dòng)全自動(dòng)血樣體積3mL7.5mL4mL5mL10mL適應(yīng)癥早、中和晚期肺癌晚期乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌晚期肺癌、胰腺癌、乳腺癌晚期癌腫晚期癌腫早期（I期）敏感性67%0%20%(2/10)未報(bào)道未報(bào)道中晚期敏感性89%25%（22/87)61%-88%30%40%報(bào)告時(shí)間6h/12樣本6h/8樣本48h/1樣本48h/1樣本3天可視化否是是是是第三十頁，共60頁。唯一獲得CFDA批準(zhǔn)的肺癌CTC檢測試劑盒第三十一頁，共60頁。CTCs：可反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)CancerControl,2015肺癌輔助診斷——降低胸部CT假陽性率，減少肺癌漏診肺癌化療療效評估——評估腫瘤功能活性狀態(tài)，彌補(bǔ)RECIST標(biāo)準(zhǔn)不足第三十二頁，共60頁。CTCs：可反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)CancerControl,2015肺癌輔助診斷——降低胸部CT假陽性率，減少肺癌漏診肺癌化療療效評估——評估腫瘤功能活性狀態(tài)，彌補(bǔ)RECIST標(biāo)準(zhǔn)不足第三十三頁，共60頁。1210例受試者肺癌560例肺部良性疾病350例其他腫瘤(150例)肝癌30例結(jié)直腸癌30例乳腺癌30例胃癌30例食管癌30例331例A100例B50例C（21例D)

79例DA:

基線CTC檢測B：術(shù)前術(shù)后CTC監(jiān)測C：一線含鉑雙藥化療中CTC監(jiān)測D：基線CTC、CEA、CYFRA21-1、SCC、NSE檢測300例A50例D健康人150例100例A50例D150例A非動(dòng)態(tài)研究肺癌560例A肺部良性疾病350例A健康人150例A動(dòng)態(tài)監(jiān)測研究

非小細(xì)胞肺癌100例B

50例C對比研究肺癌100例D肺部良性疾病50例D

健康人50例D腫瘤特異性研究其他腫瘤150例A

CytoploRare?（FR靶向PCRCTC檢測）

臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)（1210例,最大樣本量）JiataoLou,etal.PlosOne2013;YueYu,etal.TranslOncol2012;XiaoxiaChen,etal.JTO2015第三十四頁，共60頁。特征例數(shù)(%)肺癌（n=560）年齡（平均值，范圍）59.3歲(21-79歲)性別（男性/女性）349/211TNM分期Ⅰ期150(26.8%)Ⅱ期48(8.6%)Ⅲ期157(28.0%)Ⅳ期205(36.6%)病理亞型非小細(xì)胞肺癌465(83.0%)肺腺癌320(68.8%)肺鱗癌107(23.0%)大細(xì)胞肺癌5(1.1%)肺腺鱗癌1(0.2%)其他非小細(xì)胞肺癌32(6.9%)小細(xì)胞肺癌81(14.5%)其他肺癌14(2.5%)肺部良性疾?。╪=350）年齡（平均值，范圍）50.1歲(18-80歲)性別（男性/女性）310/140健康人（n=150）年齡（平均值，范圍）34.7歲(22-60歲)性別（男性/女性）69/81患者特征JiataoLou,etal.PlosOne2013;YueYu,etal.TranslOncol2012;XiaoxiaChen,etal.JTO2015第三十五頁，共60頁。不同CTC計(jì)數(shù)對于肺癌診斷的特異性與敏感性CTC計(jì)數(shù)診斷肺癌敏感性診斷肺癌特異性2.099.5%2.3%4.096.1%21.3%6.089.5%44.8%8.778.0%83.6%10.068.1%90.3%12.054.1%95.2%14.040.1%97.6%16.027.6%98.1%18.020.5%98.6%20.016.2%99.5%第三十六頁，共60頁。CytoploRare?（FR靶向PCRCTC檢測）

葉酸受體陽性CTC作為診斷標(biāo)志物最大樣本量CTC檢測數(shù)據(jù)Cutoff：

8.70CTCUnits/3mL敏感性：79.6%特異性：88.2%JiataoLou,etal.PlosOne2013;YueYu,etal.TranslOncol2013;XiaoxiaChen,etal.JTO2015AUC:0.8797第三十七頁，共60頁。CytoploRare?（FR靶向PCRCTC檢測）

所有肺癌，敏感性提高3倍；I期肺癌提高10倍CTCCEANSECA211SCCAAll80.9%33.8%25.4%49.7%29.5%StageⅠ67.5%11.3%5.6%28.6%8.8%StageⅡ61.9%30%6%55%24.7%StageⅢ、Ⅳ83.2%37.3%30%52%30.1%第三十八頁，共60頁。CTC對肺癌的診斷顯著優(yōu)于一般腫瘤標(biāo)志物輔助診斷指標(biāo)AUC值P值CTC0.91P<0.0001CEA0.56NSE0.61CYFRA21-10.71SCCA0.49CTC與一般腫瘤標(biāo)志物對肺癌診斷的準(zhǔn)確性（AUC值）第三十九頁，共60頁。單項(xiàng)CTC檢測的輔助診斷價(jià)值優(yōu)于多個(gè)一般腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合AUC=0.91,P<0.0001AUC=0.76第四十頁，共60頁。不同病理類型中，CTC輔助診斷價(jià)值均優(yōu)于一般腫瘤標(biāo)志物第四十一頁，共60頁。CTC對Ⅰ期肺癌的陽性檢出率高達(dá)67.2%其他最優(yōu)的腫瘤標(biāo)志物的敏感度僅為32.3%第四十二頁，共60頁?！?cm肺癌總體敏感性:62.5%患者編號CTCUnits/3mL病理診斷TNM分期臨床分期-整理nodulediameter（CT）110.53肺腺癌T1aN0M0Ⅰ0.320.04肺腺癌T1N0M0Ⅰ0.333.83肺腺癌T1N0M0Ⅰ0.548.78肺腺癌tisTis0.558.77肺腺癌T1aN0M0Ⅰ0.663.93肺腺癌T1N0M0Ⅰ0.773.98肺腺癌T2aN0M0Ⅰ0.884.84肺腺癌T1N0M0Ⅰ0.8910.32肺腺癌T1aN0M0Ⅰ11013.55肺鱗癌T1N0M0Ⅰ1116.29肺腺癌T1aN0M0Ⅰ11212.65肺腺癌T1N0M0Ⅰ11314.999074肺腺癌T1aN0M0Ⅰ0.3142.5497534肺腺癌T1aN0M0Ⅰ0.5156.2322726肺腺癌T1aN0M0Ⅰ0.51611.312907肺腺癌T1aN0M0Ⅰ0.61714.444199肺腺癌T1aN0M0Ⅰ0.6187.1141741肺腺癌T1aN0M0Ⅰ0.71911.134588肺腺癌T1N0M0Ⅰ0.72011.56小細(xì)胞肺癌T2aNxM0Ⅰ0.72113.461248肺腺癌T1aN0M0Ⅰ0.72210.009388肺腺癌T1aN0M0Ⅰ0.82317.296369肺腺癌T1aN0M0Ⅰ0.82410.44506其他肺癌T1aN0M0Ⅰ0.92511.8572肺腺癌T1aN0M0Ⅰ0.9268.7681014其他肺癌T1aN0M0Ⅰ12710.092346肺腺癌T1N0M0Ⅰ12811.787912肺腺癌T1aN0M0Ⅰ1299.2499084肺腺癌T1aN0M0Ⅰ13012.696456肺腺癌T1aN0M0Ⅰ13113.279299肺腺癌T1aN0M0Ⅰ13215.906467肺腺癌T1aN0M0Ⅰ1第四十三頁，共60頁。腫瘤大小CT特異性（％）CT＋CTC特異性（％）≤30mm(n＝134）59.79420-30mm(n＝44)65.995.510-20mm(n＝69)55.192.8<10mm(n＝21)61.995.2CTC聯(lián)合CT可以大大提高小結(jié)節(jié)診斷的特異性CTC輔助CT可以將小結(jié)節(jié)的判別假陽性率降低到<10%LouJT,WangL,etalInsubmission第四十四頁，共60頁。上海市胸科醫(yī)院：病例一腫瘤標(biāo)志物檢測值結(jié)果正常值CTC10.45CU/3mL升高＜8.7CEA1.29ng/mL正常0-10CYFRA21-13.26ng/mL正常0-3.3NSE13.0ng/mL正常0-20SCCA0.9ng/mL正常0-3CA12511.6U/mL正常＜35VATS右肺上葉切除術(shù)：右肺上葉細(xì)支氣管肺泡癌（非粘液性），T1aN0M0，直徑0.8cm第四十五頁，共60頁。腫瘤標(biāo)志物檢測值結(jié)果正常值CTC13.46CU/3mL升高＜8.7CEA1.03ng/mL正常0-10CYFRA21-12.91ng/mL正常0-3.3NSE2.34ng/mL正常0-20SCCA1.59ng/mL正常0-3VATS右肺上、中葉切除+系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃：術(shù)后病理確診：右上葉腺癌（非粘液性）、細(xì)支氣管肺泡癌及肺泡樣混合亞型，高分化，T1aN0M0腫瘤大?。?.5*0.7*0.4cm上海市胸科醫(yī)院：病例二第四十六頁，共60頁。CTCs：可反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)CancerControl,2015肺癌輔助診斷——降低胸部CT假陽性率，減少肺癌漏診肺癌化療療效評估——評估腫瘤功能活性狀態(tài)，彌補(bǔ)RECIST標(biāo)準(zhǔn)不足第四十七頁，共60頁。CTC：用于化療療效評估，先于腫瘤大小發(fā)生變化，評估腫瘤功能狀態(tài)NSCLC,1st-linecarboplatin,paclitaxel(d);NSCLC,2nd-linepemetrexed(e)BaselineCTscanswerebeforetherapyinitiationandCTCmeasurementsbeganatorshortlyafterthefirsttreatment.第四十八頁，共60頁。CTC數(shù)量變化與RECIST標(biāo)準(zhǔn)基本一致第四十九頁，共60頁。相同SD患者，CTC下降患者PFS可能更長第五十頁，共60頁。1210例受試者肺癌560例肺部良性疾病350例其他腫瘤(150例)肝癌30例結(jié)直腸癌30例乳腺癌30例胃癌30例食管癌30例331例A100例B50例C（21例D)

79例DA:

基線CTC檢測B：術(shù)前術(shù)后CTC監(jiān)測C：一線含鉑雙藥化療中CTC監(jiān)測D：基線CTC、CEA、CYFRA21-1、SCC、NSE檢測300例A50例D健康人150例100例A50例D150例A非動(dòng)態(tài)研究肺癌560例A肺部良性疾病350例A健康人150例A動(dòng)態(tài)監(jiān)測研究

非小細(xì)胞肺癌100例B

50例C對比研究肺癌100例D肺部良性疾病50例D

健康人50例D腫瘤特異性研究其他腫瘤150例A

JiataoLou,etal.PlosOne2013;YueYu,etal.TranslOncol2012;XiaoxiaChen,etal.J