第八章基因工程與體外表達

GeneEngineeringandGeneExpression

分子生物學研究中心

1目的要求掌握：限制性核酸內(nèi)切酶的概念與特點；質(zhì)粒載體的特點；基因克隆的基本過程。了解：其他常用工具酶的特點?！局攸c】基因克隆的基本過程。2

基因工程是指在體外對DNA分子按照既定的目的和方案，對DNA進行剪切和重新連接，然后把它導入宿主細胞，從而能夠擴增有關(guān)DNA片段，表達有關(guān)基因產(chǎn)物，進行DNA序列分析，基因治療，研究基因表達的調(diào)節(jié)因子（如啟動子、增強子等），以及研究基因的功能等。3限制性核酸內(nèi)切酶的特點類型限制性修飾作用識別位點切割位點Ⅰ型有有特異識別位點下游100到1000bpⅡ型有無特異可知、固定Ⅲ型有有特異識別位點附近切割DNA，切割位點很難預測。52．限制性內(nèi)切酶的命名

EcoRⅠE代表Escherichia屬

co代表coli種

R代表RY13株65’GAATTC3’3’CTTAAG5’

5’

G3’CTTAAAATTC3’G5’5’5’3．限制性內(nèi)切酶的識別和切割位點

通常是4～6個堿基對、具有回文序列（palindrome）的DNA片段，大多數(shù)酶是錯位切割雙鏈DNA，產(chǎn)生5ˊ或3ˊ黏性末端（stickyend）。如EcoRⅠ切割后產(chǎn)生5ˊ黏性末端：7二、T4DNA連接酶（T4DNAligase）

催化雙鏈DNA一端3ˊ-OH與另一雙鏈DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯鍵，使具有相同黏性末端或平端的DNA兩端連接起來。

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第二節(jié)基因克隆的載體

載體是攜帶目的基因，使其在宿主細胞內(nèi)復制或表達的DNA分子。10一、常用的克隆載體

(一)質(zhì)粒（plasmid）是存在于多數(shù)細菌和某些真核生物染色體外的雙鏈環(huán)狀的DNA分子。1113(二)λ噬菌體

野生型λ噬菌體經(jīng)過改造，已衍生出100多種克隆載體。λ噬菌體載體分為插入型和替換型(置換型)兩類。目前應用較廣的是EMBL系列、λgt系列和Charon系列等。

14λgt10和λgt11載體適用于建立cDNA文庫。這兩個載體都屬插入型載體，能克隆7kb以下的外源DNA。λ

gt11為表達型載體。1517(四)黏性質(zhì)粒（cosmid）

是由λ噬菌體的黏性末端（cos區(qū)）與質(zhì)粒重新構(gòu)建的載體，為雙鏈、環(huán)狀DNA。其克隆容量可達40～50kb。18(五)病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、EB病毒等作為基因轉(zhuǎn)移的載體。多數(shù)病毒載體均已質(zhì)?；?，病毒載體質(zhì)粒主要由病毒啟動子、包裝元件、選擇性遺傳標記，以及pBR322的復制子組成。19

multiplecloningsite21(二)真核表達載體

含有原核復制起始位點、抗生素抗性基因.還含有真核表達元件,包括啟動子、增強子、克隆位點、轉(zhuǎn)錄終止信號和poly(A)加尾信號.22

第三節(jié)基因克隆的基本過程

基因克隆主要步驟：①制備目的基因和選擇相關(guān)載體②目的基因和有關(guān)載體進行連接③重組的DNA導入受體細胞④DNA重組體的篩選和鑒定⑤DNA重組體的擴增、表達和其他研究23幾種常用克隆載體的比較注：+表示可用；-表示不可用比較內(nèi)容質(zhì)粒λ噬菌體黏性質(zhì)粒M13噬菌體克隆容量<10kb<22kb40～50kb<1kb基因組DNA文庫-++-cDNA文庫++--亞克隆+--+序列分析++-+E.coli表達++--二、載體的選擇與準備25三、DNA分子的體外連接（一）黏性末端（二）人工接頭的使用（三）加入同聚體尾（四）平端連接26（三）加入同聚體尾待克隆DNA片段重組質(zhì)?；旌?、退火空白質(zhì)粒29（四）平端連接30四、外源DNA導入宿主細胞

（一）轉(zhuǎn)化（transformation）（二）感染（infection）（三）轉(zhuǎn)染（transfection）

31五、目的基因的篩選和鑒定

外源基因?qū)胨拗骷毎?，篩選含有目的基因的陽性克隆并加以擴增。所用的方法主要有遺傳學方法、免疫學方法、核酸雜交法、PCR等。32（一）

遺傳學方法

插入滅活法1.332.藍-白篩選（α互補）

許多載體（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和氨基端145個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點。這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細胞。宿主和載體編碼的片段各自均無酶活性，但它們可以互補形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal轉(zhuǎn)化成藍色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍色的菌落。如果在多克隆位點上插入外源DNA片段，將使lacZ基因滅活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，結(jié)果菌落呈現(xiàn)白色。343536（二）免疫學方法

如果克隆基因的產(chǎn)物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表達，因而可用相應的抗血清或單克隆抗體，通過放射免疫、化學發(fā)光或顯色反應進行篩選。

37（三）核酸雜交法

對菌斑或菌落進行原位分子雜交是從基因組文庫、cDNA文庫或重組質(zhì)粒中篩選目的基因的最有效的方法之一，而且這種篩選不取決于目的基因是否表達。38菌落原位雜交的原理

轉(zhuǎn)化E.coli并鋪于瓊脂平板上將膜放置平板表面