體外分析技術(shù)

臨床核醫(yī)學(xué)診斷治療體外分析技術(shù)體內(nèi)檢查法放射性核素顯像功能（非顯像）測(cè)定臨床核醫(yī)學(xué)

體外分析技術(shù)體外放射分析體外非放射分析一.體外放射分析（invitroradioassay）(一）.概要：1.定義：

指在體外實(shí)驗(yàn)條件下，以結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，以放射性核素標(biāo)記物為示蹤劑，以放射性測(cè)量為定量手段，對(duì)微量物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)的一類核技術(shù)的總稱。

1960年由美國(guó)學(xué)者Yalow和Berson創(chuàng)立放射免疫分析。

使生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域微量物質(zhì)定量分析技術(shù)取得了劃時(shí)代的進(jìn)展。它使得那些原先認(rèn)為是無(wú)法測(cè)定而又具有重要生物學(xué)意義的微量物質(zhì)得以精確定量.從而為進(jìn)一步揭開(kāi)生命奧秘打開(kāi)了一條新的道路，使人們有可能在分子水平上重新認(rèn)識(shí)某些生命現(xiàn)象的生化生理基礎(chǔ)。

1977年，這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)明者榮獲諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

.放射免疫分析(radioimmunoassayRIA)

；.免疫放射分析(immunoradiometricanalysis,IRMA)；.競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合分析(competitiveprotein-bindinganalysisCPBA)

；.放射受體結(jié)合分析；.放射性酶結(jié)合分析。

目前這些技術(shù)迅速滲透到醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，如內(nèi)分泌學(xué)、病毒學(xué)、藥理學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、法醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)等，以及與醫(yī)學(xué)生物學(xué)相關(guān)的學(xué)科，如農(nóng)業(yè)科學(xué)、生態(tài)學(xué)及環(huán)境科學(xué)等。測(cè)定的種類可包括生物體內(nèi)所有具有免疫原性的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，多肽，激素，藥物，酶類，核酸，細(xì)胞因子等。

2.特點(diǎn)（1）靈敏度高（10-9~~10-15g)

靈敏度是指可以檢測(cè)到的最小化學(xué)量。（2）特異性強(qiáng)特異性是指測(cè)量方法中所用的抗體或結(jié)合劑對(duì)被測(cè)物質(zhì)特異結(jié)合的性質(zhì)，也是指它的專一性。（3）放射性核素不引入人體。（4)操作簡(jiǎn)單，樣品用量少，應(yīng)用范圍廣。（二）.基本原理

（以放射免疫分析為例）

免疫分析是以抗原與其特異性抗體的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，利用待測(cè)抗原及定量標(biāo)記抗原與限量的特異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，以放射性測(cè)量為定量手段，檢測(cè)待測(cè)抗原濃度的方法。其競(jìng)爭(zhēng)抑制可用下式來(lái)表示：1.基本反應(yīng)模式：

AgAgAb+Ab*Ag*AgAb

Ag:未標(biāo)記抗原（標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)抗原）;*Ag:標(biāo)記抗原;Ab:抗體，

AgAb:未標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，*AgAb:標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物。

反應(yīng)體系的條件：（1）.標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原免疫活性一致，共同競(jìng)爭(zhēng)性與抗體相結(jié)合；（2）.標(biāo)記抗原、抗體量恒定，且標(biāo)記抗原與未標(biāo)記抗原量之和大于抗體上有效結(jié)合點(diǎn)的數(shù)目。（3）.反應(yīng)呈雙向進(jìn)行，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，反應(yīng)式兩端的摩爾濃度相對(duì)穩(wěn)定；（4）.標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的生成量取決于未標(biāo)記抗原的濃度，兩者呈逆相關(guān)函數(shù)關(guān)系。2.競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線（標(biāo)準(zhǔn)曲線）

既用已知的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別與定量的標(biāo)記抗原和抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，分離結(jié)合及游離部分，并分別測(cè)量其放射性，則不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品就得到相應(yīng)的不同標(biāo)記抗原抗體結(jié)合率，以其為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，就可繪出一條競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。Ag2550100200400800*AgAb分離B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456B%？7B00B0%B%B/F603.基本步驟

加樣(Ag*AgAb)溫育（反應(yīng)達(dá)到平衡）分離放射性測(cè)量數(shù)據(jù)處理質(zhì)量控制（評(píng)價(jià)）（四）.基本技術(shù)

1.標(biāo)準(zhǔn)品(standardpreparation)；2.標(biāo)記抗原(labelledantigen)；3.特異性抗體(specificantibody

);4.合適的分離技術(shù)(separationmethod).

1.標(biāo)準(zhǔn)品(Standardpreparation)：

是放射免疫分析定量的依據(jù)，要求其與待測(cè)物化學(xué)結(jié)構(gòu)免疫活性一致、性能穩(wěn)定、不含干擾免疫反應(yīng)物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)品濃度選擇應(yīng)滿足生理病理范圍。2.標(biāo)記抗原(labelledantigen)：

a.放射性核素的選擇--125I

，3H，14C；

b.標(biāo)記抗原與未標(biāo)記抗原免疫活性一致；

c.標(biāo)記抗原有一定比度（比度指單位質(zhì)量物質(zhì)所具有的放射性強(qiáng)度KBq/ug）；

d.放射化學(xué)純度（標(biāo)記抗原放射性占總放射性的百分比）：要求大于95%。

3.特異性抗體(specificantibody)

要求：特異性強(qiáng)、親和力大、合適的滴度。

（1）特異性(Specificity)：

測(cè)定方法中所用的抗體或結(jié)合劑對(duì)被測(cè)物特異結(jié)合的性質(zhì)，指不受交叉反應(yīng)物影響的程度。評(píng)價(jià)指標(biāo)為交叉反應(yīng)率。

鑒定方法：

（2）親和力(Affinity)

：

指配體與結(jié)合劑之間的結(jié)合強(qiáng)度，以抗體的親和常數(shù)（Ka值）表示。

（3）合適的滴度(Titer)

：指抗血清最佳稀釋度的選擇。測(cè)定方法：把抗血清用緩沖液稀釋成不同濃度，各取系列稀釋度加入到試管中，然后加入一定量的標(biāo)記抗原，按常規(guī)放免操作，反應(yīng)達(dá)平衡后，分離結(jié)合與游離部分，測(cè)結(jié)合率；以稀釋度為橫坐標(biāo)，以結(jié)合率為縱坐標(biāo)繪制抗血清稀釋曲線。以結(jié)合50%標(biāo)記抗原時(shí)所對(duì)應(yīng)的稀釋度為抗體的滴度，變化范圍40%-60%之間。

4.合適的分離技術(shù)(separationmethod)：4.合適的分離技術(shù)(separationmethod)：要求：a.使結(jié)合、游離部分分離完全；b.分離過(guò)程不破壞原平衡體系；c.分離方法簡(jiǎn)便迅速，非特異結(jié)合少，適合大批樣品檢測(cè)。

.常用分離技術(shù)：

（1）沉淀法(precipitationmethod)

：

常用的試劑為有機(jī)試劑（如聚乙二醇PEG）或中性鹽（如硫酸銨、硫酸鈉等），其有很強(qiáng)的脫水作用，使抗體分子失去表面水殼層而沉淀下來(lái)，而抗原在同樣濃度的分離劑中不會(huì)沉淀，從而達(dá)到分離結(jié)合抗原和游離抗原的目的。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、分離迅速、試劑易得價(jià)廉。

缺點(diǎn)：為非特異性結(jié)合高，易受蛋白濃度、PH值、離子強(qiáng)度與環(huán)境溫度等影響。（2）雙抗法(doubleantibodymethod)

：

為一種免疫分離技術(shù)，用第一抗體免疫另一動(dòng)物得到抗抗體或稱第二抗體，它能與第一抗體形成的復(fù)合物結(jié)合而沉淀下來(lái)。

優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定和非特異性結(jié)合低，是一種特異性分離技術(shù)。

缺點(diǎn)：分離時(shí)間長(zhǎng)，二抗用量大費(fèi)用高，易受血清蛋白濃度及補(bǔ)體的干擾。（3）沉淀加雙抗法

雙抗體法非特異結(jié)合低，但所需時(shí)間長(zhǎng)，抗體用量大，PEG法操作簡(jiǎn)便快速，但非特異結(jié)合高。采用雙抗體與PEG聯(lián)合使用，它既兼顧了雙抗體法和沉淀法的優(yōu)點(diǎn)，又克服了兩者的缺點(diǎn)，使分離更快速，非特異結(jié)合低，二抗用量少，此方法目前已被廣泛應(yīng)用。（4）固相法(solidphasemethod)

是將抗體（包括第一抗體或第二抗體）或抗原吸附在固相載體上完成，反應(yīng)達(dá)平衡后，倒去上清液中的游離部分，直接測(cè)量固相的放射性活度即為結(jié)合部分B的量。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，不需離心，分離效果好、迅速、非特異結(jié)合低。

缺點(diǎn)：制備較麻煩。（5）活性炭吸附法(activecarbonabsorptivemethod)

利用表面活性物質(zhì)能吸附小分子的游離部分，經(jīng)過(guò)離心，F(xiàn)沉淀下來(lái)，B仍保留在溶液中，從而達(dá)到分離B和F的目的。常用的吸附劑有葡聚糖包被的活性炭（DCC）、硅酸鎂、滑石