氧化應(yīng)激與消化道功能(gōngnéng)的關(guān)系匯報(bào)(huìbào)人：朱麗慧上海交通大學(xué)2010年10月17日第一頁，共四十一頁。主要內(nèi)容氧化(yǎnghuà)損傷的機(jī)理氧化應(yīng)激與消化道損傷抗氧化劑對(duì)氧化損傷的修復(fù)作用展望第二頁，共四十一頁。氧化(yǎnghuà)應(yīng)激腸炎(chángyán)腸蠕動(dòng)紊亂(wěnluàn)急性炎癥心血管疾病代謝疾病神經(jīng)紊亂第三頁，共四十一頁。一、氧化(yǎnghuà)損傷的機(jī)理生物體在代謝過程中，產(chǎn)生許多自由基，這些自由基通常不會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷，機(jī)體依靠自身體內(nèi)的抗氧化防御體系，可以保護(hù)機(jī)體組織、細(xì)胞，防止(fángzhǐ)自由基的損傷。當(dāng)生物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基的水平高于細(xì)胞的抗氧化防御能力時(shí)，氧化還原狀態(tài)失衡，過量的自由基存在于組織或細(xì)胞內(nèi)，即誘發(fā)氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致氧化損傷。第四頁，共四十一頁。氧化(yǎnghuà)損傷DNA氧化損傷堿基損傷DNA鏈的斷裂蛋白質(zhì)過氧化受體和酶細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化磷脂過氧化·NO·自由基輻射高氧高溫應(yīng)激第五頁，共四十一頁。脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的氧化會(huì)對(duì)生物體造成不同程度的危害，從而(cóngér)影響機(jī)體的生長、發(fā)育、衰老等過程。急性和慢性的應(yīng)激都能通過產(chǎn)生自由基誘導(dǎo)胃腸道的氧化應(yīng)激。其中對(duì)消化道的氧化損傷在動(dòng)物生產(chǎn)中發(fā)生率最高、隱蔽性強(qiáng)、危害性大。過量的自由基極易誘發(fā)消化道疾病，給畜牧業(yè)的發(fā)展造成巨大損失。第六頁，共四十一頁。腸道的功能：

◆消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)◆免疫◆內(nèi)分泌◆粘膜屏障腸道粘膜是機(jī)體自身與外環(huán)境接觸的最大界面(jièmiàn),具有選擇性滲透吸收營養(yǎng)物質(zhì)和防御腸道內(nèi)微生物及致炎因子入侵等屏障功能。第七頁，共四十一頁。腸粘膜屏障功能

阻止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)如致病微生物、抗原和促炎因子進(jìn)入血液循環(huán)的作用，從而維護(hù)動(dòng)物體健康。

當(dāng)此功能由于各種原因如感染、缺血、燒傷、急性胰腺炎等而損傷時(shí)，即可引起(yǐnqǐ)腸粘膜通透性增高，進(jìn)一步引起(yǐnqǐ)腸道細(xì)菌移位和促炎因子大量釋放，從而加重原發(fā)疾病，甚至誘發(fā)多臟器功能紊亂和衰竭的發(fā)生。第八頁，共四十一頁。腸粘膜屏障構(gòu)成

機(jī)械(jīxiè)屏障化學(xué)屏障生物屏障免疫屏障機(jī)械屏障(píngzhàng)

機(jī)械屏障主要由緊密連接的粘膜上皮細(xì)胞以及鞘液凝膠層組成?；瘜W(xué)屏障主要是胃酸、膽汁酸、粘液、溶菌酶、乳鐵蛋白和各種消化酶等對(duì)阻止致病因子(yīnzǐ)入侵，維護(hù)腸粘膜屏障具有重要作用。第九頁，共四十一頁。生物屏障

在生理狀態(tài)下機(jī)體的腸道存在大量共生細(xì)菌，它們通過分泌細(xì)菌毒素、產(chǎn)生短鏈脂肪酸、促進(jìn)腸蠕動(dòng)、占據(jù)致病菌粘附位點(diǎn)以及爭奪營養(yǎng)素等多個(gè)環(huán)節(jié)防止有害細(xì)菌的侵入，維護(hù)動(dòng)物體健康(jiànkāng)。而保持菌群間合適的數(shù)量與比例，對(duì)于維護(hù)腸粘膜屏障的完整性至關(guān)重要。

免疫屏障

腸道相關(guān)淋巴組織包括腸集合淋巴小節(jié)，固有(gùyǒu)膜淋巴細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，是機(jī)體內(nèi)最大的免疫器官，在腸道執(zhí)行局部免疫功能，并與其它因素協(xié)同作用，維護(hù)腸粘膜屏障功能。第十頁，共四十一頁。二、氧化應(yīng)激與消化道損傷(sǔnshāng)氧化應(yīng)激產(chǎn)生自由基直接作用于細(xì)胞發(fā)揮作用。主要有四種致細(xì)胞損傷機(jī)制：

1）對(duì)脂類和細(xì)胞膜的破壞,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。2）對(duì)蛋白質(zhì)、酶的損傷,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,功能(gōngnéng)喪失和酶失活。3）對(duì)核酸和染色體的破壞,從而導(dǎo)致DNA鏈的斷裂,染色體的畸變和斷裂。4）對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的破壞,從而使細(xì)胞外基質(zhì)變得疏松,彈性降低。第十一頁，共四十一頁。對(duì)消化道粘膜結(jié)構(gòu)形態(tài)的損傷

腸粘膜中的細(xì)胞膜過脂質(zhì)氧化，損傷腸粘膜組織，腸粘液層變薄、絨毛變短、絨毛表面積減少、隱窩變淺，過氧化物和自由基刺激(cìjī)腸道腺體分泌，引起腸炎的發(fā)生，而腹瀉又加劇了腸道粘膜組織的損傷程度。氧化應(yīng)激對(duì)消化道功能(gōngnéng)的影響第十二頁，共四十一頁。對(duì)消化道屏障和吸收功能的影響

當(dāng)腸道內(nèi)氧自由基增加時(shí)，會(huì)使腸道中耐受能力較弱的乳酸菌數(shù)量減少，大腸桿菌的數(shù)量上升(shàngshēng)。營養(yǎng)素的吸收依賴于腸吸收細(xì)胞膜完整性，腸粘膜損傷，致使大量吸收細(xì)胞受到破壞，嚴(yán)重影響小腸吸收功能。第十三頁，共四十一頁。對(duì)腺體的功能影響

氧自由基的提高(tígāo)誘導(dǎo)生長抑素（somatostatin,SS）的分泌，SS具有廣泛的內(nèi)分泌抑制作用，抑制生長激素、生長調(diào)節(jié)素C以及多種胃腸道激素。仔豬斷奶后，攝入的豆類蛋白種胰蛋白酶抑制因子會(huì)引起胰腺炎癥，導(dǎo)致與消化功能紊亂。第十四頁，共四十一頁。正常(zhèngcháng)大鼠腸結(jié)構(gòu)馬可，2006靜脈注射(jìnɡm(xù)àizhùshè)LPS后腸道病理變化第十五頁，共四十一頁。

對(duì)照組誘導(dǎo)組修復(fù)組對(duì)照組、LPS誘導(dǎo)組和復(fù)合抗氧化劑修復(fù)組空腸(kōngcháng)光鏡照片(×4)趙珂立，待發(fā)表(fābiǎo)第十六頁，共四十一頁。胃潰瘍慢性胃炎消化性潰瘍胃癌結(jié)腸(jiécháng)疾病自由基與胃腸道疾病(jíbìng)氧自由基學(xué)說認(rèn)為(rènwéi)：幽門螺旋桿菌(Hp)致慢性胃炎的主要因素之一，而其誘發(fā)機(jī)制可能同氧自由基有關(guān)。與自由基有關(guān)，其中主要與NO及O2-有關(guān)，氧自由基能直接作用于細(xì)胞的大分子，同時(shí)可作為細(xì)胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)引起細(xì)胞漿內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子(如NF-kB)激活，引起核內(nèi)有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄增加。是很多急性、慢性炎癥及免疫失調(diào)等疾病發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。人和動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，病變腸黏膜中ROS產(chǎn)生明顯增多，ROS同疾病活動(dòng)性相關(guān)。在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)給予自由基清除劑可以預(yù)防難治性潰瘍復(fù)發(fā)，促進(jìn)其愈合。

流行病學(xué)調(diào)查揭示，抗氧化劑如維生素C和維生素E的缺乏與胃癌發(fā)生有關(guān)。補(bǔ)充維生素C可減少胃粘膜中的DNA損害。第十七頁，共四十一頁。氧化(yǎnghuà)損傷的檢測方法直接檢測法電子自旋共振法

又稱電子自旋共振(electronspinresonance,ESR),是反應(yīng)活性高、壽命短的自由基最直接最有效的測定方法?！顑?yōu)點(diǎn)：靈敏度高,能檢測(jiǎncè)到絕大多數(shù)的自由基。☆缺點(diǎn)：自旋波譜儀價(jià)格昂貴,操作復(fù)雜,在普通實(shí)驗(yàn)室中難以推廣。第十八頁，共四十一頁。電子自旋共振(gòngzhèn)波譜儀

第十九頁，共四十一頁。化學(xué)發(fā)光法常用魯米諾(luminol,5-胺基-鄰苯二甲酰環(huán)肼)、光澤精等作為發(fā)光增效劑。其原理為,魯米諾被ROS自由基氧化(yǎnghuà)成激發(fā)態(tài)的氨基肽鹽離子,當(dāng)其返回基態(tài)時(shí)放出大量光子,從而對(duì)化學(xué)發(fā)光起放大作用。操作簡單,價(jià)格低廉,目前被廣泛用于ROS的檢測和研究。第二十頁，共四十一頁。間接(jiànjiē)測定法脂質(zhì)過氧化損傷的測定測定丙二醛的量常常可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接反映出細(xì)胞損傷的程度。常用硫代巴比妥酸法來測定丙二醛含量,此法是應(yīng)用最多也是最古老的方法。第二十一頁，共四十一頁。DNA氧化損傷的檢測DNA被氧化時(shí),鳥苷酸的C-8是最易發(fā)生損傷的位點(diǎn)。因而,由此形成的8-羥基脫氧鳥苷是評(píng)價(jià)DNA氧化損傷最常使用的生物標(biāo)志物。8-羥基脫氧鳥苷的特異性單克隆抗體(kàngtǐ)，彗星實(shí)驗(yàn)又稱單細(xì)胞凝膠電泳。蛋白質(zhì)氧化損傷的檢測

其傳統(tǒng)(chuántǒng)的檢測技術(shù)是使用二硝基苯肼的比色法,使用分光光度法或者酶聯(lián)免疫吸附法測定2,4-二硝基苯肼與蛋白質(zhì)羰基反應(yīng)生成的腙,來衡量蛋白質(zhì)的損傷情況。第二十二頁，共四十一頁。抗氧化酶類的檢測超氧化物歧化酶的檢測SOD

SOD能通過歧化作用清除氧自由基，測定SOD的活力可間接反應(yīng)組織細(xì)胞抗氧化損傷、機(jī)體清除自由基的能力。直接法和間接法,包括(bāokuò)電泳法、免疫法、ESR法、化學(xué)發(fā)光法、脈沖輻解法、紫外分光光度計(jì)法等。第二十三頁，共四十一頁。谷胱甘肽過氧化物酶的測定

是一種抗氧化酶,在氧化應(yīng)激條件(tiáojiàn)下,其在細(xì)胞的濃度明顯減少?？刹捎米贤夥止夤舛扔?jì)法、分光光度法或者酶聯(lián)免疫吸附法等進(jìn)行測定。過氧化氫酶的測定過氧化氫酶是一種酶類清除劑，其機(jī)制實(shí)質(zhì)上是過氧化氫的歧化,必須有兩個(gè)過氫化氫先后與過氧化氫酶相遇且碰撞在活性中心上,才能(cáinéng)發(fā)生反應(yīng)。過氧化氫濃度越高,分解速度越快。一般也采用紫外分光光度法對(duì)其進(jìn)行檢測。第二十四頁，共四十一頁。氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞(xìbāo)凋亡的檢測方法氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測主要通過光鏡伊紅染色或吉姆薩染色和電鏡對(duì)凋亡的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察,可觀察到染色質(zhì)濃縮,核膜起皺破裂,凋亡小體形成等,以判別細(xì)胞凋亡。第二十五頁，共四十一頁。

磷脂酰絲氨酸外翻分析(fēnxī)ROS致細(xì)胞凋亡的早期改變之一是細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)向細(xì)胞膜外。膜粘連蛋白5對(duì)轉(zhuǎn)向到細(xì)胞膜外的細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸有高度的親和性。用異硫氰酸熒光素標(biāo)記膜粘連蛋白5,結(jié)合使用碘化丙啶對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色,即可區(qū)別凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞。第二十六頁，共四十一頁。DNA片斷化檢測

氧化應(yīng)激致細(xì)胞凋亡時(shí)，其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA斷裂,形成50～300kb長的DNA大片段,或者180～200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,健康活細(xì)胞DNA電泳為一條(yītiáo)區(qū)帶,而凋亡細(xì)胞DNA電泳出現(xiàn)特征性的階梯狀條帶。有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種。第二十七頁，共四十一頁。陳群，2007應(yīng)激24h細(xì)胞(xìbāo)DNA瓊脂糖電泳圖第二十八頁，共四十一頁。氧化損傷致細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的檢測Bcl-2基因的檢測：Bcl-2的過度表達(dá)能阻抑多種凋亡相關(guān)基因的表達(dá),如caspase23的表達(dá)。測定方法主要有印跡雜交和實(shí)時(shí)熒光定量法。p53基因的檢測；是細(xì)胞生長周期中負(fù)調(diào)節(jié)因子，氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷的過程(guòchéng)必須有p53參與。常采用免疫組織化學(xué)、原位雜交等方法來檢測。核因子kB基因的檢測（NF-kB）：在正常情況下是復(fù)合物，氧化應(yīng)激狀態(tài)下,NF-kB從復(fù)合體中解離并向核內(nèi)移動(dòng),與位于核內(nèi)的基因序列上特異性調(diào)控區(qū)結(jié)合,從而激活受調(diào)控的基因表達(dá)。免疫化學(xué)染色法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、原位雜交法。第二十九頁，共四十一頁。三、抗氧化(yǎnghuà)劑對(duì)氧化(yǎnghuà)損傷的修復(fù)作用抗氧化物質(zhì)主要的作用機(jī)制：通過提供活性基團(tuán)，作為供氫體與自由基反應(yīng)，使之形成相應(yīng)的離子或分子，滅活自由基，終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；提高(tígāo)抗氧化酶活性，降低膜的流動(dòng)性，從而降低自由基反應(yīng)，達(dá)到抑制脂質(zhì)過氧化作用。第三十頁，共四十一頁。酶類抗氧化劑超氧化物歧化酶(SOD)谷胱甘肽過氧化物(ɡuòyǎnɡhuàwù)酶(GSH-Px)過氧化氫酶(CAT)非酶類抗氧化劑VE硒VC新型天然抗氧化劑茶多酚類黃酮中草藥微生物源性抗氧化劑第三十一頁，共四十一頁。酶類抗氧化劑對(duì)各自由基的作用(zuòyòng)示意圖CATGSH-Px第三十二頁，共四十一頁。韓雪，2010不同抗氧化劑對(duì)應(yīng)激小鼠增重(zēnɡzhònɡ)的影響第三十三頁，共四十一頁。不同抗氧化劑對(duì)力竭游泳(yóuyǒng)后小鼠血清中SOD活性的影響韓雪，2010第三十四頁，共四十一頁。不同抗氧化劑對(duì)力竭游泳后小鼠血清中MDA含量(hánliàng)的影響韓雪，2010第三十五頁，共四十一頁。不同抗氧化劑對(duì)力竭(lìjié)游泳后小鼠肝臟中CAT活性的影響韓雪，2010第三十六頁，共四十一頁。項(xiàng)目

對(duì)照組誘導(dǎo)組修復(fù)組第1日體重雌200.00±10.10200.50±1.64203.50±3.94雄208.33±5.92210.67±4.46205.67±4.27第7日體重雌238.50±9.05232.83±5.71226.67±4.41雄278.50±14.36273.67±10.56262.00±5.90第15日體重雌255.33±8.48256.67±20.27259.00±10.66雄332.50±14.67305.67±4.46294.83±14.20第22天體重雌260.00±6.87

252.00±5.33

255.67±14.62

雄355.00±13.63a321.00±6.95b340.83±14.16b日增重(g)雌2.48±0.232.15±0.032.35±0.70雄6.15±0.14b5.48±0.18a5.70±0.44a復(fù)合抗氧化劑對(duì)LPS損傷大鼠體重(tǐzhòng)的影響趙珂立，2010未發(fā)表(fābiǎo)第三十七頁，共四十一頁。項(xiàng)目對(duì)照組誘導(dǎo)組修復(fù)組肝臟指數(shù)(mg/g)34.40±24.38a30.57±10.11b40.19±10.89bMDA(nmol/ml)4.51±0.29a5.07±0.1