第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術及應用二微生物的選擇培養(yǎng)和計數2第1章發(fā)酵工程高壓蒸汽滅菌液體培養(yǎng)基學習目標核心素養(yǎng)1.舉例說明通過調整培養(yǎng)基的配方可有目的地培養(yǎng)某種微生物。2．概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計數法是測定微生物數量的常用方法。1.生命觀念：各類微生物都能適應其生活環(huán)境。2．科學思維：根據微生物的代謝類型配制選擇培養(yǎng)基。3．科學探究：討論土壤中分解尿素的細菌的分離與計數的方法。（三）微生物的數量測定1.間接計數法——稀釋涂布平板法（1）原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。樣品的稀釋度將直接影響平板上的菌落數目。稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數（三）微生物的數量測定1.間接計數法——稀釋涂布平板法（2）計數原則

①一般選擇菌落數為30～300的平板計數；

②在同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值。

③適當的稀釋度、涂布是否均勻是成功統(tǒng)計菌落數目的關鍵。分析實驗結果時，要考慮重復組結果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實驗。（3）結果分析：①統(tǒng)計的菌落數往往比活菌的實際數目少；

原因：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。

②統(tǒng)計結果一般用菌落數而不是用活菌數來表示。（三）微生物的數量測定1.間接計數法——稀釋涂布平板法每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×MM代表稀釋倍數；C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數；V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)（4）計算公式：某同學在稀釋倍數為106

的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數的平均數為234，那么每g樣品中的菌落數是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B例題1：甲同學做此實驗在稀釋倍數105獲得3個平板，菌落數分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1ml菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細菌數目？（80+90+100）/30.1×105=9×107個例題2：每毫升原液所含細菌數＝每小格平均細菌數×400×10000×稀釋倍數缺點：①統(tǒng)計的結果一般是活菌數和死菌數的總和，不能區(qū)分死菌與活菌（數值偏大）。②需要相對高的細菌濃度。③不適于對運動細菌的計數（1）原理：利用特定的細菌計數板或血細胞計數板在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量。

細菌計數板可對細菌等較小的細胞進行觀察和計數，血細胞計數板常用于相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等的觀察和計數。（三）微生物的數量測定2.直接計數法——顯微鏡直接計數（比例計數法）待測樣品等量的已知含量的紅細胞混勻涂抹測定：

紅細胞數目細菌數目計算單位體積內的細菌數目

將含已知數目的紅細胞液體與待測的菌液按1：1均勻混合，在顯微鏡下數出各自的數目，然后求菌液中的細胞數目。細菌紅細胞顯微鏡直接計數是測定微生物的方法。例：已知紅細胞濃度為M個/mL，從體積為NmL的大腸桿菌培養(yǎng)液中取出大腸桿菌液與紅細胞液等量均勻混合后，涂片，染色，鏡檢。在同一視野中發(fā)出有紅細胞W個，大腸桿菌Y個，求NmL大腸桿培養(yǎng)液中大腸桿菌的個數X是多少？X＝N×M×YW(個)觀察到的紅細胞平均數/觀察到的細菌平均數＝紅細胞含量/細菌含量公式探究·實踐·土壤中分解尿素的細菌的分離與計數1.實驗目的（1）從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌。（2）統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌。2.實驗原理絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分離尿素的細菌。CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2組分含量KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0gH2O定容至1000mL3.實驗步驟（1）土壤取樣①取樣地點要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤。細菌適宜在該環(huán)境中生長。（細菌適宜在該環(huán)境中生長）②取樣過程：鏟去表層土（一般3cm左右）。（細菌絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。）

取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。探究·實踐·土壤中分解尿素的細菌的分離與計數（2）制備培養(yǎng)基

①選擇培養(yǎng)基

以尿素為唯一氮源

②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

作為對照組，來判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml3.實驗步驟探究·實踐·土壤中分解尿素的細菌的分離與計數①每個濃度至少設置4個平板，1、2、3平板是選擇培養(yǎng)基（實驗組，三個重復），4為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用）；不涂布稀釋液的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；以驗證培養(yǎng)基中是否含有雜菌；在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。3.實驗步驟探究·實踐·土壤中分解尿素的細菌的分離與計數（3）樣品的稀釋與涂布平板另外，整個實驗還要設置2個平板，是哪兩個？目的？①每個濃度至少設置4個平板，1、2、3平板是選擇培養(yǎng)基（實驗組，三個重復），4為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用）；在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。3.實驗步驟探究·實踐·土壤中分解尿素的細菌的分離與計數（3）樣品的稀釋與涂布平板注意事項：本實驗使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標記。例如，在標記培養(yǎng)皿時應該注明組別、培養(yǎng)日期和平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等；在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。3.實驗步驟探究·實踐·土壤中分解尿素的細菌的分離與計數（3）樣品的稀釋與涂布平板②不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數在30～300之間適于計數的平板。

測細菌數：一般用104、105、106稀釋液。測放線菌：一般用103、104、105稀釋液。測真菌數：一般用102、103、104稀釋液。思考：在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數？

選用稀釋范圍更大的稀釋液進行平板培養(yǎng)；例如可以將1×103至1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數為30-300的平板進行計算。（4）微生物的培養(yǎng)與觀察①培養(yǎng)條件：不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌一般在30～37℃的溫度下培養(yǎng)1～2d。②觀察：每隔24h統(tǒng)計一次菌落數目，選取菌落數目穩(wěn)定時的記錄作為結果。防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數目。③一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。3.實驗步驟探究·實踐·土壤中分解尿素的細菌的分離與計數1.結合對照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。2.你是否獲得了某一稀釋度下菌落數為30～300的平板?在這一稀釋度下，是否至少有2個平板的菌落數接近?結果分析與評價探究·實踐·土壤中分解尿素的細菌的分離與計數

如果沒有接種的培養(yǎng)基上沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。如果接種后的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）上的菌落數明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數，說明選擇培養(yǎng)基篩選出了一些尿素分解菌。

如果得到了兩個或多個菌落數為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進行菌落的計數。3.在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數目的實驗時，A同學從對應的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落，分析其原因。原因：（1）土樣不同（2）培養(yǎng)基污染或操作失誤小結：通過這個事例可以看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。方案一：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗。如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結果分析與評價探究·實踐·土壤中分解尿素的細菌的分離與計數在以尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基中分離出的微生物都是能分解尿素的嗎？不一定。因為有些微生物可以利用其他微生物的代謝產物進行生長繁殖。思考：1.原理：細菌合成的脲酶將尿素分解為氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，pH升高，因此可以通過檢測培養(yǎng)基pH的變化來判斷是否發(fā)生了該化學反應，進而判斷該菌是否為尿素分解細菌。2.方法：在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅：（1）液體培養(yǎng)基可以直接看液體的變色情況；（2）固體培養(yǎng)基上可以觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅色環(huán)帶，紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強。

拓展——分解尿素細菌的進一步鑒定CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3脲酶陰性脲酶陽性

在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。

拓展——分解尿素細菌的進一步鑒定課堂總結微生物的數量測定選擇培養(yǎng)基的作用微生物選擇培養(yǎng)獲取純培養(yǎng)物的方法-稀釋涂布平板法微生物的選擇培養(yǎng)和計數選擇培養(yǎng)基微生物的選擇培養(yǎng)科學實例篩選原則選擇培養(yǎng)基的概念及舉例稀釋涂布平板法的操作過程間接計數法—稀釋涂布平板法直接計數—計數板計數法土壤中分解尿素的細菌的分離與計數培養(yǎng)基的制備實驗設計（1）土壤取樣（2）樣品的稀釋（3）稀釋涂布平板法接種（4）微生物的培養(yǎng)與觀察實驗設計1.如表所示為某微生物培養(yǎng)基的配方。下列說法中不正確的是（）A.此培養(yǎng)基屬于固體培養(yǎng)基，其中的碳源是（CH2O）B.配制培養(yǎng)基時，溶化后分裝前必須要進行的是滅菌C.接種時應在酒精燈火焰附近操作D.若用該培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)纖維素分解菌，應除去青霉素，加入纖維素粉課堂練習成分NaNO3K2HPO4KClMgSO4·7H2O含量3g1g0.5g0.5g成分FeSO4（CH2O）H2O青霉素含量0.01g30g定容至1000mL0.1萬單位A2.下圖是研究人員從紅棕壤中篩選高效分解尿素細菌的示意圖,有關敘述錯誤的是()A.在配制步驟②、③的培養(yǎng)基時,應先調pH值后高壓蒸汽滅菌B.步驟③純化分解尿素的原理是將聚集的細菌分散,可以獲得單細胞菌落C.步驟③采用涂布平板法接種,并需