色譜分離基本原理“兩相分配，相似相溶”色譜柱結(jié)構(gòu)色譜柱有方向性，主要與裝填技術(shù)有關(guān)。篩板的內(nèi)部孔形態(tài)會(huì)影響柱效規(guī)格內(nèi)徑長(zhǎng)度粒徑碳載量孔徑比表面積材質(zhì)封端表觀規(guī)格：柱管材質(zhì)，填料分類，尺寸，粒徑隱藏信息：碳載量，平均孔徑，比表面積，封端，鍵合類型，pH范圍，最大耐壓，篩板孔徑等WatersXBridgeShieldRP184.6*250mm

5um柱效拖尾載樣量（體積）載樣量（濃度）分離度回收率你能正確連接它們嗎？填料硅膠等載體（正相色譜）硅膠+鍵合相（反相色譜）聚合物+鍵合相（離子交換，手性色譜柱等）整體柱（空間排阻色譜等）反相色譜C18填料硅膠注意：硅膠顆粒大小分布金屬殘留內(nèi)部孔徑實(shí)心核顆粒四乙氧基硅烷(TEOS)硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷(MPEOS)甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)改性硅膠硅膠快速溶解嚴(yán)重的柱失效柱壽命短暫因嵌入硅甲基的阻擋,顆粒表面溶解速度明顯減緩柱壽命大大延長(zhǎng)pH范圍可達(dá)1~11普通硅膠柱waters改性硅膠柱堿性條件下硅膠溶解單、雙、三官能團(tuán)鍵合三官能團(tuán)鍵合二官能團(tuán)鍵合單官能團(tuán)鍵合鍵合

碳載量影響殘留硅羥基比率

鍵合相流失率鍵合密度常見鍵合相

主要作用機(jī)理疏水疏水π-π疏水疏水氫鍵

π-π氫鍵氫鍵陽(yáng)離子交換陰離子交換空間位阻：異丙基硅氧烷，異丁基硅氧烷增加pH范圍，但有限，一般1~9空間位阻AgilentPhenomenex空間位阻抗水解AgilentXDB極性嵌入Waters“Shield”內(nèi)嵌極性基團(tuán)固定相：水表面層可能機(jī)理水“屏蔽”層改善與水的浸潤(rùn)性－100%水溶液兼容降低了堿性化合物的保留降低了拖尾現(xiàn)象屏蔽了帶負(fù)電的硅羥基極性基團(tuán)增加了表面層水的濃度

與鍵合相的疏水性作用雙重保留機(jī)理:1).與鍵合相的的疏水性作用;2).與殘余硅醇基間的離子交換作用O-SiO-SiO-

O-SiO-SiO-

O-SiO-

O-SiO-SiO-SiO-

O--SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+當(dāng)流動(dòng)相pH值小于3時(shí),硅醇基呈中性(未解離)

BaseBase對(duì)堿性化合物的保留及嚴(yán)重拖尾兩實(shí)驗(yàn)使用相同的傳統(tǒng)C8硅膠柱離子交換作用堿性分析物在硅膠柱上的拖尾機(jī)理當(dāng)流動(dòng)相為pH6-8時(shí),硅醇基帶負(fù)電性(大部解離)既然pH<3時(shí)硅醇基離解受抑制，為何不在所有情況下采用酸性條件進(jìn)行分離?低pH可導(dǎo)致分離選擇性的喪失!---堿性基團(tuán)離子化，極性增加pH7.0pH2.0amitriptylinenortriptyline常用封尾end-capped：三甲基硅氧烷極性封尾，增加極性保留由于空間位阻的存在，鍵合反應(yīng)最多只能覆蓋50%的硅羥基，超過一半硅羥基是活性硅羥基，與堿性基團(tuán)會(huì)發(fā)生離子交換作用，增加了保留，導(dǎo)致峰形拖尾，用短鏈氯硅烷（如三甲基氯硅烷）鍵合活性的硅羥基，可以減小這種影響，這種操作被稱為封尾，封端，封口。封端封端–封口殘余硅羥基–減少不可逆吸附或拖尾–增加碳含量（0.1%-1%）封端現(xiàn)代色譜柱三大技術(shù)平臺(tái)親水AQ柱ECOSILODS-AQAtlantisDc18,T3SynergiHydro-RPHILIC柱Zic-HILICHypersilGOLDHILICAtlantisHILIC柱目的：提高極性化合物保留寬pH色譜柱ECOSILODS-ExtendXbridge/XterraC18/C8GeminiC18ZorbaxExtend目的：提高色譜柱pH使用范圍純硅膠柱ECOSILODS-SHPurospherSTARRP18eSymmetryC18極性嵌入柱ECOSILODS-EPSZorbax-BonusRP18SymmetryshieldRP18目的：改善峰形未濕潤(rùn)的孔濕潤(rùn)的孔注意：保留時(shí)間與填料表面積與配體有關(guān)。然而，如果硅膠表面未濕潤(rùn)，那么有效的色譜表面積會(huì)減少95%，因此，減少被分析物的保留時(shí)間即等于“疏水塌陷”，記住：幾乎所有的表面積都在孔內(nèi)！低比例有機(jī)溶劑或純水溶液流動(dòng)相C18

硅膠什么是“疏水塌陷”？疏水塌陷分0246810流動(dòng)相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被分析物沒有保留“濕潤(rùn)時(shí)”“去濕后”疏水塌陷此時(shí)色譜柱并沒有“壞”，如何復(fù)原：低比例有機(jī)相低流速?zèng)_洗過渡，然后高比例低流速。停流速后(孔去濕:~3%)流動(dòng)相：0.1%醋酸水溶液Minutes0246810初始時(shí)保留時(shí)間無(wú)變化阿莫西林極性嵌入色譜柱：無(wú)疏水塌陷現(xiàn)象發(fā)生內(nèi)嵌極性基團(tuán)鍵合相：使用高比例水溶液流動(dòng)相時(shí)色譜性能穩(wěn)定疏水塌陷極性保留機(jī)理：離子交換+疏水作用1、極性封尾2、極性嵌入3、低碳載量4、保留硅羥基5、增加極性嵌入鍵合相AQ柱對(duì)極性與非極性化合物的優(yōu)異保留特性在100％水溶液流動(dòng)相中運(yùn)行保持色譜性能穩(wěn)定峰形優(yōu)異超低鍵合相流失，質(zhì)譜兼容酸性條件下穩(wěn)定性良好在高水相、低pH條件下具有較長(zhǎng)的色譜柱壽命極佳的色譜柱間重現(xiàn)性碳載量低，不適合分離復(fù)雜組份和強(qiáng)堿性化合物

突破硅膠柱應(yīng)用禁區(qū)的有力手段優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)無(wú)機(jī)基質(zhì)(C18–硅膠)

機(jī)械強(qiáng)度高柱效高保留穩(wěn)定

有限的pH應(yīng)用范圍對(duì)堿性分析物拖尾化學(xué)不穩(wěn)定性有機(jī)基質(zhì)(高聚物)

很寬的pH應(yīng)用范圍無(wú)離子型作用化學(xué)穩(wěn)定性好

機(jī)械強(qiáng)度不佳柱效低保留行為難以預(yù)測(cè)寬pH值色譜柱寬pH柱pH對(duì)填料穩(wěn)定性的影響高pH實(shí)驗(yàn)pH>8時(shí),許多C18硅膠基質(zhì)過早地喪失柱效由于填料顆粒溶解,色譜柱內(nèi)產(chǎn)生空隙隨著鍵合相覆蓋率的增加，色譜柱壽命延長(zhǎng)低pH實(shí)驗(yàn)pH<2時(shí),許多C18硅膠基質(zhì)過早地喪失柱效由于鍵合相之水解作用,被測(cè)物喪失保留行為使用三官能團(tuán)鍵合相可獲得最佳的穩(wěn)定性寬pH柱寬pH值色譜柱的幾種類型Agilent雙齒鍵合寬pH柱Waters雜化顆粒基質(zhì)溶解度

(ppm)12345678910 12240-220-200-180-160-140-120-100-80-60-40-20-0-pH基質(zhì)溶解度曲線傳統(tǒng)硅膠柱適用范圍pH2-7

各種基質(zhì)的液相柱在高pH中溶解速率的比較液相柱基體材料的溶解導(dǎo)致柱前端形成空腔，由此而造成色譜峰畸形、分叉?，F(xiàn)代超純硅膠柱適用范圍pH2-8寬pH值色譜柱適用范圍pH1-12柱效下降，柱壓升高的原因

鍵合相流失

保留時(shí)間的急劇下降是因?yàn)槭杷?/p>

硅膠溶解坍塌死吸附，硅膠內(nèi)孔堵塞

篩板堵塞

稀釋劑與流動(dòng)相差異大或流動(dòng)相急劇變化導(dǎo)致的柱內(nèi)析晶壓力波動(dòng)大致柱床松動(dòng)，渦流效應(yīng)增大Q我的色譜柱壽命為何不長(zhǎng)?

您是否有恰當(dāng)?shù)臉悠非疤幚硎侄?

樣品前處理(凈化和富集)的好壞不僅影響分析結(jié)果的靈敏度和可靠性，而且直接影響色譜柱的壽命您的色譜柱是否有適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施?

在線過濾器保護(hù)柱您的色譜柱是否曾暴露在過于劇烈的分離條件?

使用某些對(duì)填料基體有腐蝕性的高濃度緩沖鹽

(如在中性或堿性pH區(qū)域使用高濃度緩沖鹽的磷酸鹽或硼酸鹽)

柱溫過高

將色譜柱暴露在極端pH的流動(dòng)相中

Q選擇性與pH影響帶離子型官能團(tuán)的待測(cè)物如：胺，羧酸及酚類等pH不影響不能發(fā)生電離的中性物質(zhì)的保留大多數(shù)藥物含有一個(gè)或多個(gè)離子型官能團(tuán)pH變化引起的選擇性變化最大Q化合物從離子化狀態(tài)變化到非離子化狀態(tài)其保留因子變化10到30倍上述變化相當(dāng)于有機(jī)溶劑的比例變化20%pH帶來(lái)最顯著的選擇性變化pH是方法開發(fā)最強(qiáng)有力的選擇性調(diào)節(jié)工具重要的方法開發(fā)為何要從新色譜柱開始？

隨使用條件和樣品潔凈度的不同，多數(shù)色譜柱在使用過程中可發(fā)生化學(xué)污染、表面狀態(tài)改變、基體材料部分溶解等等潛在變化。此類改變可導(dǎo)致柱內(nèi)填料的活化或鈍化，使其對(duì)某些化合物的分離選擇性加強(qiáng)或變劣。此類特殊分離選擇性常常是無(wú)法重復(fù)的。在此類舊色譜柱建立起來(lái)的方法將無(wú)法在新柱和其他舊色譜柱上得以重現(xiàn)，造成未來(lái)可能需要重新開發(fā)方法或進(jìn)行大量針對(duì)儀器系統(tǒng)、色譜柱和流動(dòng)相的不必要的診斷工作。

Q反相色譜柱的選擇小結(jié):常規(guī)應(yīng)用現(xiàn)代高純硅膠色譜柱：優(yōu)點(diǎn)：峰形好