第三章分光光度技術(shù)分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來(lái)鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的技術(shù)。第一節(jié)光學(xué)原理把電磁波按頻率大小，從頻率最小的無(wú)線電波到頻率最大的γ射線排列，既為電磁波的波譜電磁波譜當(dāng)光線通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí)，透過(guò)光的強(qiáng)度會(huì)減弱。因?yàn)樗殖闪巳糠郑阂徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?，一部分被組成此溶液的物質(zhì)所吸收，其余便是透過(guò)光的強(qiáng)度。即：入射光=反射光+分散光+吸收光+透過(guò)光

“空白”校正：在檢測(cè)過(guò)程中，若用蒸餾水或待測(cè)溶液的溶劑作為“空白”校正反射、分散等因素所造成的入射光的損失，則：入射光(I。)=吸收光+透過(guò)光(I)分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來(lái)鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的技術(shù)。吸收光譜（absorptionspectrum）即物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收程度不同而產(chǎn)生的光譜。分子對(duì)各個(gè)波長(zhǎng)的光吸收程度不同，這是分子的結(jié)構(gòu)特性所決定的。物質(zhì)所發(fā)射的光是具有波粒二象性：

微粒性

波動(dòng)性E為光子的能量；ν為光波的頻率（Hz）；h為普朗克常數(shù)（6.626）；c為光速（2.9977×108m／s）；λ為光波的波長(zhǎng)

光波具有一定的頻率。不同單色光的顏色不同，即因其頻率不同所致。不同頻率的光波在真空中的傳播速度相同。根據(jù)光的速度(c)和頻率(v)可計(jì)算出它的波長(zhǎng)(入

)S2S1S0S3E2E0E1E3h物質(zhì)的吸收光譜:在連續(xù)光譜中某些波長(zhǎng)的光被物質(zhì)吸收后產(chǎn)生的光譜被稱(chēng)作吸收光譜,包括分子吸收光譜和原子吸收光譜。吸收光譜取決于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。從一個(gè)有連續(xù)光譜的光源，逐步地分出各個(gè)波長(zhǎng)的光，使其透過(guò)待測(cè)物的真溶液，測(cè)出其在不同波長(zhǎng)時(shí)的光密度；然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，就可以得到待測(cè)物的吸收光譜曲線；由此找出其中吸收最強(qiáng)的波長(zhǎng)，作為靈敏光波長(zhǎng)對(duì)該物質(zhì)未知液液進(jìn)行定量測(cè)定。曲線1-細(xì)菌葉綠素a；曲線2-葉綠素a；曲線3-葉綠素b；曲線4-藻膽紅素；曲線5-β-類(lèi)胡蘿卜素朗伯-比爾定律：

I0：入射光強(qiáng)度C:溶液濃度

b:液層厚度I:透射光強(qiáng)度

T:透光度A:吸光度

k:吸光系數(shù)bI0I朗伯-比爾定律的適用條件：

1.入射光為單色光。波長(zhǎng)范圍越大，單色光純度越低，偏離越大；

2.溶液中鄰近分子的存在并不改變每一給定分子的特性，即分子間互不干擾。

3.適用于分子吸收和原子吸收。光譜分析技術(shù)的分類(lèi)

分子吸收法:可見(jiàn)與紫外分光光度法、紅外光譜法分子光譜

分子發(fā)射法:分子熒光光度法光譜技術(shù)原子吸收法：原子吸收法原子光譜原子發(fā)射法：發(fā)射光譜分析法、原子熒光法等

第二節(jié)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)

分光光度計(jì):能從含有各種波長(zhǎng)的混合光中將每一單色光分離出來(lái)并測(cè)量其強(qiáng)度的儀器。分析精密度高測(cè)量范圍廣分析速度快樣品用量少射線x射線紫外光紅外光微波無(wú)線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見(jiàn)光根據(jù)使用的波長(zhǎng)范圍不同分為紫外光區(qū)、可見(jiàn)光區(qū)、紅外光區(qū)以及萬(wàn)用（全波段）分光光度計(jì)等。紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：工作波段在200nm～800nm的分光光度計(jì)。其中：200nm～400nm為紫外光區(qū)。400nm～800nm為可見(jiàn)光區(qū)。屬于分子吸收光譜儀。721可見(jiàn)分光光度計(jì)

722系列可見(jiàn)分光光度計(jì)

SP-756P紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)TENSOR系列紅外光譜儀

0.208光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示系統(tǒng)一、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)示意圖

它包括5個(gè)基本部件：光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x表光源（lightsource）：提供入射光的裝置。要求:1.能在所需波長(zhǎng)范圍的光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射連續(xù)光譜；

2.有足夠的輻射強(qiáng)度并能長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定。常用的光源有熱輻射燈（鎢燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、氘燈及氙燈等），金屬弧燈（各種汞燈）等。幾種常見(jiàn)光源比較光源波長(zhǎng)范圍(nm)

特點(diǎn)鎢燈320~2500鎢絲易蒸發(fā)，壽命短。用于可見(jiàn)光區(qū)鹵鎢燈320~2500加入鹵素使用壽命延長(zhǎng)，穩(wěn)定性好氫燈185~375用于紫外區(qū)氘燈185~375發(fā)光強(qiáng)度比氫燈高3～5倍汞燈254~734用于紫外或熒光分析儀單色器（Monochromator）：是將來(lái)自光源的復(fù)合光分解為單色光并分離出所需波段光束的裝置。入射狹縫：限制雜散光進(jìn)入；色散元件：將復(fù)合光分解為單色光，有棱鏡和光柵兩種；準(zhǔn)直鏡：將來(lái)自色散元件的平行光束聚集在出射狹縫上；出射狹縫：將固定波長(zhǎng)范圍的光射出單色器，可以限制通帶寬度。吸收池（absorptioncell）：是用來(lái)盛放被測(cè)溶液的器件。在可見(jiàn)光區(qū)常用無(wú)色光學(xué)玻璃或塑料制作；在低于350nm的紫外區(qū)需用能透紫外線的石英或熔凝石英制作。同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射應(yīng)嚴(yán)格保持一致。指紋、油污及池壁上的沉淀物都會(huì)影響吸收池的透光性能。微型吸收池（Microdrillabsorptioncell）：“光程/體積比”提高了近10倍。多光路吸收池（Multipie-pathabsorptioncell）：在吸收池壁上裝有反射鏡，使光線在溶液中經(jīng)多次反射后才離開(kāi)吸收池，大大增加了有效光程，提高了測(cè)定的靈敏度。通過(guò)改進(jìn)吸收池的幾何形狀，可提高“光程/體積比”，即盡可能延長(zhǎng)單位體積的光程。常用的有：檢測(cè)器：把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的裝置。對(duì)檢測(cè)器的要求：

1、產(chǎn)生的電信號(hào)與照射到它上面的光強(qiáng)有恒定的函數(shù)關(guān)系；

2、波長(zhǎng)響應(yīng)范圍大；

3、靈敏度高；

4、響應(yīng)速度快，一般要求小于10-8s；

5、產(chǎn)生的電信號(hào)易于檢測(cè)、放大，噪聲低。檢測(cè)器工作原理

光照射在某些金屬表面，會(huì)有光電子從金屬表面逸出，這種光電效應(yīng)稱(chēng)為外光電效應(yīng)。利用外光電效應(yīng)可以制成光電管和光電倍增管。光深入到物體內(nèi)部，將物體內(nèi)部原子中的一部分束縛電子激發(fā)成自由電子，但這些電子并不逸出物體，而是留在物體內(nèi)部從而使物體導(dǎo)電性增強(qiáng)，稱(chēng)為內(nèi)光電效應(yīng)。利用內(nèi)光電效應(yīng)可制成光敏電阻、光敏二極管以及光電池。幾種常用檢測(cè)器比較檢測(cè)器

工作原理

特點(diǎn)光電管外光電效應(yīng)簡(jiǎn)單,靈敏度低光電倍增管外光電效應(yīng)與多級(jí)二次發(fā)射體相結(jié)合靈敏度比光電管高200多倍光電二極管陣列外光電效應(yīng)，由一行光敏區(qū)和二行讀出寄存器構(gòu)成可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)波長(zhǎng)的光強(qiáng)度。壽命長(zhǎng)、光譜響應(yīng)范圍寬、可靠性高、讀出速度快光電池內(nèi)光電效應(yīng)結(jié)實(shí)、便宜、使用方便。但產(chǎn)生的電流大小不穩(wěn)定電荷耦合器件模擬集成電路芯片能同時(shí)多譜線檢測(cè)，極大地提高分析速度第三節(jié)分光光度技術(shù)的應(yīng)用

一、測(cè)定溶液中物質(zhì)的含量可見(jiàn)或紫外分光光度法都可用于測(cè)定溶液中物質(zhì)的含量。比色法：這需要測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度已知的溶液)和未知液(濃度待測(cè)定的溶液)的吸光度，將兩者進(jìn)行比較。由于所用吸收池的厚度是一樣的，可用下式進(jìn)行計(jì)算。

Ax/As=KCxL/KCsL，即：Cx=Ax×Cs/As式中Cx代表未知液的濃度，Cs代表標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，Ax和As分別代表未知液和標(biāo)準(zhǔn)液所測(cè)得的吸光度值，式中只有Cx是未知的，可由上式計(jì)算得之。分光度法：可以先測(cè)出不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在選定的濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該是一條直線.然后測(cè)定出未知液的吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到其相對(duì)應(yīng)的濃度。含量測(cè)定時(shí)所用波長(zhǎng)通常要選擇被測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)，這樣做有兩個(gè)好處：①靈敏度大，物質(zhì)在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；②可以避免其他物質(zhì)的干擾。

二、用紫外光譜鑒定化合物

使用分光光度計(jì)可以繪制吸收光譜曲線。方法是用各種波長(zhǎng)不同的單色光分別通過(guò)某一濃度的溶液，測(cè)定此溶液對(duì)每一種單色光的吸光度以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制吸光度—波長(zhǎng)曲線，此曲線即吸收光譜曲線。各種物質(zhì)有它自己一定的吸收光譜曲線，因此用吸收光譜曲線圖可以進(jìn)行物質(zhì)種類(lèi)的鑒定當(dāng)一種未知物質(zhì)的吸收光譜曲線和某一已知物質(zhì)的吸收光譜曲線形狀一樣時(shí)，則很可能它們是同一物質(zhì)。一定物質(zhì)在不同濃度時(shí)，其吸收光譜曲線中峰值的大小不同，但形狀相似，即吸收高峰和低谷的波長(zhǎng)是一定不變的。

紫外光吸收是由不飽和的結(jié)構(gòu)造成的，含有雙鍵的化合物能表現(xiàn)出吸收峰。紫外光吸收光譜比較簡(jiǎn)單，同一種物質(zhì)的紫外光吸收光譜應(yīng)完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結(jié)構(gòu)不一定相同。除了特殊情況外，單獨(dú)依靠紫外光吸收光譜不能決定一個(gè)未知物的結(jié)構(gòu)，必須與其他方法配合。紫外光吸收光譜分析主要用于已知物質(zhì)的定量分析和純度分析。第四節(jié)分光光度法的誤差

在分光光度法中，即使將各種因素都控制好，對(duì)于濃度過(guò)大或過(guò)小的樣品，誤差仍然很大。濃度過(guò)大的樣品，其吸光度過(guò)高，影響檢測(cè)器的靈敏度，且讀數(shù)標(biāo)尺刻度的精度差，誤差亦大，故難于準(zhǔn)確。濃度過(guò)低的樣品，其吸光度小，則因與儀器本身因素有關(guān)，也容易引起檢測(cè)器標(biāo)尺上的讀數(shù)誤差。例如光源波動(dòng)的影響：當(dāng)光源強(qiáng)度改變1％、吸光度為1.0時(shí)，只有0.4％的誤差，但在吸光度為O.045時(shí)，則可產(chǎn)生9.6％的誤差。實(shí)際上，在整個(gè)透光度(或吸光度)范圍的不同部分均有不同的誤差。從理論上推算，相對(duì)誤差的最小的部分在透光度為36.8％處(或吸光度為O.4343處)故通常認(rèn)為測(cè)定值在吸光度0.20～0.80范圍內(nèi)(透光度為20％～65％)誤差較小，超出此范圍，相對(duì)誤差均會(huì)增大?！咀⒁馐马?xiàng)】1.儀器須安放在穩(wěn)固的工作臺(tái)上，不能隨意搬動(dòng)。嚴(yán)防震動(dòng)，潮濕和強(qiáng)光直射。2.盛裝比色液時(shí)，約達(dá)比色皿2/3體積，不宜過(guò)多或過(guò)少。若不慎使溶液流至比色皿外面須用棉花或拭鏡紙擦干，才能放入比色架。拉比色桿時(shí)要輕，以防溶液濺出，腐蝕機(jī)械。3.千萬(wàn)不可用手或?yàn)V紙等物摩擦比色皿的透光面。4.比色皿用后應(yīng)立即用自來(lái)水沖洗干凈，若不能洗凈，用5%中性皂溶液或洗衣粉溶液浸泡，也可用新鮮配制的重鉻酸鉀洗液短時(shí)間浸泡，然后用水沖洗干凈，倒置晾干。5.每套分光光度計(jì)上的比色皿和比色皿架不得隨意更換。6.試管或試劑不得放置于儀器上，以防試劑濺出腐蝕機(jī)殼。7.如果試劑濺在儀器上，應(yīng)立即用棉花或紗布擦干。8.測(cè)定溶液濃度的光密度值宜在0.1—0.7之間最符合光吸收定律，線性好，讀數(shù)誤差較小。如光密度超過(guò)0.1—1.0范圍，可調(diào)節(jié)比色液濃度，適當(dāng)稀釋或加濃，再進(jìn)行比色。9.合上檢測(cè)室蓋連續(xù)工作的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以防光電管疲乏。每次讀完比色架內(nèi)的一組讀數(shù)后，立即打開(kāi)檢測(cè)室蓋。10.儀器連續(xù)使用不應(yīng)超過(guò)2小時(shí)，必要時(shí)間歇半小時(shí)再用。11.測(cè)定未知液時(shí)，先作該溶液的