微衛(wèi)星引物開發(fā)及RAPD分子標(biāo)記鑒別植物性別一、微衛(wèi)星引物開發(fā)簡單重復(fù)序列(simplesequencerepeat，SSR)由1-5個核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)組成的長達幾十個核苷酸的序列,重復(fù)數(shù)為10~20次含有串聯(lián)重復(fù)的核心序列兩側(cè)較保守的側(cè)翼序列

動物體中以雙核苷酸(CA/GT)n最為常見。植物基因組中(AT)n最為常見，其次是(GA)n和(CA)n1、微衛(wèi)星定義微衛(wèi)星重復(fù)序列區(qū)非重復(fù)特異序列區(qū)相關(guān)文獻近源種的引物數(shù)據(jù)庫搜尋法（NCBI等）根據(jù)所研究類群的基因文庫中篩選（目前常用的是磁珠富集法）很多物種沒有完成全基因組測序，進行SSR研究的時候需要開發(fā)引物。一、微衛(wèi)星引物開發(fā)1、從數(shù)據(jù)庫中挖掘微衛(wèi)星序列一、微衛(wèi)星引物開發(fā)從NCBI網(wǎng)站中搜索黃連木屬植物的表達序列標(biāo)簽（EST）核酸序列PCR擴增并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測利用primer5.0軟件進行引物設(shè)計利用SSRHunter1.3軟件進行微衛(wèi)星序列片段的查找EST序列的聚類和拼接，去掉可信度較低的序列片段一、微衛(wèi)星引物開發(fā)一、微衛(wèi)星引物開發(fā)2、磁珠富集法—FLASCO法（FastisolationbyAFLPofSequencesContainingrepeats）基本原理：首先用帶有生物素標(biāo)記的探針并與基因組DNA酶切片段雜交,再利用生物素與鏈親和素親和性強的特性,用包被鏈親和素的磁珠進行磁力吸附完成重復(fù)序列目標(biāo)片段的富集,進行PCR擴增,連接轉(zhuǎn)化,陽性克隆測序,從而獲得含有SSR重復(fù)序列的一種方法。植物基因組DNA的制備濃度驗證微衛(wèi)星分離酶切基因組DNA目的片段的回收（回收片段大?。┠康钠魏腿斯そ宇^的連接和擴增純化磁珠雜交富集（生物素探針標(biāo)記）克隆微衛(wèi)星文庫、篩選陽性克隆構(gòu)建微衛(wèi)星文庫從微衛(wèi)星富集文庫中篩選微衛(wèi)星測序序列分析及引物設(shè)計2、FLASCO法開發(fā)微衛(wèi)星引物一、微衛(wèi)星引物開發(fā)（1）DNA抽提

—

CTAB方法，一般利用試劑盒。（2）酶切連接

—MseI+T4Ligase（3）AFLP特異擴增DNA片段

—酶切連接液為模板

—

MesI–N引物（4）探針雜交

-5，端生物素修飾的重復(fù)堿基探針與擴增產(chǎn)物雜交（5）磁珠洗脫

—磁珠特異性吸附雜交片段，洗脫除去未雜交片段2、FLASCO法開發(fā)微衛(wèi)星引物一、微衛(wèi)星引物開發(fā)（6）雙鏈恢復(fù)

-磁珠富集得到的目的單鏈以MesI-N為引物特異擴增恢復(fù)為雙鏈（7）質(zhì)粒連接

-PMD18-Tvector（8）轉(zhuǎn)化克隆

-DH5-α感受態(tài)細胞涂板，37℃培養(yǎng)11-13h（9）單克隆擴增培養(yǎng)

-挑取白色飽滿菌落液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5h

（10）菌落PCR選擇目標(biāo)克隆

-三引物法擴增產(chǎn)物為雙帶2、FLASCO法開發(fā)微衛(wèi)星引物一、微衛(wèi)星引物開發(fā)（11）測序

-目標(biāo)克隆菌液測序（12）引物設(shè)計及優(yōu)化

-CID軟件分析序列及設(shè)計引物

-引物擴增條件優(yōu)化（13）熒光PCR及基因分型

-熒光修飾引物特異擴增

-基因分型（14）數(shù)據(jù)分析

-Genescan讀取基因分型數(shù)據(jù)

-位點多態(tài)性信息

-位點是否偏離哈溫平衡

-位點是否連鎖不平衡2、FLASCO法開發(fā)微衛(wèi)星引物一、微衛(wèi)星引物開發(fā)2、FLASCO法開發(fā)微衛(wèi)星引物一、微衛(wèi)星引物開發(fā)二、RAPD鑒定植物性別RAPD標(biāo)記是采用人工合成的10個堿基的寡核苷酸作為隨機引物,以基因組DNA為模板,通過較低的溫度條件下的PCR技術(shù)獲得特異性的序列長度約為200-3000個堿基序列,然后就可能將合成的新鏈作為下一次合成的模板，從而轉(zhuǎn)化成序列特異擴增區(qū)域，獲得特異引物，達到鑒定的目的。5’3’3’5’5’5’1、RAPD分子標(biāo)記技術(shù)2、RAPD分子標(biāo)記鑒定植物性別試驗流程雌雄基因池的構(gòu)建（BSA）隨機引物篩選（文獻＋目錄）RAPD擴增RAPD特異片段的回收與克隆陽性克隆進行測序SCAR特異引物的設(shè)計、合成SCAR引物的驗證二、RAPD鑒定植物性別Primer類型SequenceOPO08RAPDCCTCCAGTGTBC1200RAPDGCCTGATTGCS1RAPDGTTTCGCTCCS281RAPDGTGGCATCTCS218RAPDGATGCCAGACS263RAPDGTCCGGAGTGS281-1S281-2SCAR5'-CCTGGTTGCTTGTGTTGATTAG-3'5'-GAGTGTCATCAAGCCATCTGTC-3'二、RAPD鑒定植物性別表2.1RAPD分子標(biāo)記中隨機引物和特異性引物試驗號TaqDNApolymerase(U)Primer(μmol.L-1)dNTPs(mmol.L-1)Mg2+(mmol.L-1)DNA模板ng/μL-110.50.250.253.01.520.750.350.152.51.531.00.350.253.52.041.250.250.152.02.050.50.30.153.52.560.750.20.252.02.571.00.20.153.01.081.250.350.252.51.090.50.20.32.52.0100.750.350.23.02.0111.00.350.32.01.5121.250.20.23.51.513