乙型肝炎病毒血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

臨清市疾病預(yù)防控制中心

乙肝病毒研究歷史

1963年Blumberg在澳洲土著人血清中發(fā)現(xiàn)，簡(jiǎn)稱澳抗。1970年Dane發(fā)現(xiàn)HBV病毒顆粒，稱Dane顆粒1983年將HBV歸為嗜肝病毒科3我國(guó)HBV感染概況一般人群HBsAg攜帶率高達(dá)7.18%；現(xiàn)有慢性HBV感染者約9300萬(wàn)人，占全世界的1/4；其中慢性乙型病毒性肝炎患者超過(guò)

2000萬(wàn)例，占全世界慢性乙肝患者的1/3；15歲以下兒童HBsAg攜帶率下降顯著，1-4歲組僅為0.96%。3

病毒形態(tài)與基因結(jié)構(gòu)嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)正肝DNA病毒屬電鏡：3種形態(tài)結(jié)構(gòu)和基因HBV的基因組長(zhǎng)約3.2kb，非閉合的雙股環(huán)狀DNA。短鏈：為正鏈，長(zhǎng)度是長(zhǎng)鏈的50％～100％長(zhǎng)鏈：為負(fù)鏈，含HBV全部遺傳信息有4個(gè)開(kāi)放讀碼框架：

S區(qū)：編碼HBsAg；前S1抗原、前S2抗原

C區(qū)：編碼HBcAg和HBeAg；

X區(qū)：編碼HBxAg，并與肝細(xì)胞癌變有關(guān)

P區(qū)：編碼DNA多聚酶。其中S區(qū)和前S區(qū)的基因容易發(fā)生變異。HBV基因組和基因表達(dá)產(chǎn)物3200bp4openreadingframes7proteins

大蛋白(preS1-preS2-S)

中蛋白(preS2-S)

小蛋白(HBsAg)

核衣殼(HBcAg)HBeAg

聚合酶X蛋白HBV基因型的世界分布基因型分布的國(guó)家和地區(qū)ABCDEFGH西歐、北歐、北美、中非東南亞、中國(guó)、日本東亞、中國(guó)、日本、波利尼西亞等南歐、地中海、印度西非美國(guó)土著人、波利尼西亞、中南美美國(guó)、法國(guó)尼加拉瓜、墨西哥、美國(guó)血清型adw2ayw1adw2ayw1adw2adrq+adrq-ayrayw2ayw3ayw4adw4q-adw2ayw4adw2?機(jī)體感染HBV后產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，形成多種不同的抗原抗體系統(tǒng)表面抗原抗體系統(tǒng)(HBsAg，抗-HBs)e抗原抗體系統(tǒng)(HBeAg，抗-HBe)核心抗原抗體系統(tǒng)(HBcAg，抗-HBc)

HBsAg

最早出現(xiàn)的血清學(xué)標(biāo)志之一是HBV感染的基本標(biāo)志

HBsAg陽(yáng)性見(jiàn)于乙肝的潛伏期、急性期慢性乙肝病毒攜帶與HBV感染有關(guān)的肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌抗-HBs

特異性中和抗體、保護(hù)性抗體抗-HBs陽(yáng)性可見(jiàn)于乙型肝炎恢復(fù)期，在HBsAg消失后間隔一定時(shí)間抗-HBs出現(xiàn)隱性感染的健康人，自身產(chǎn)生了免疫力注射乙肝疫苗或乙肝高效價(jià)免疫球蛋白(HBIG)后，產(chǎn)生的主動(dòng)或被動(dòng)免疫HBeAg

與HBsAg平行出現(xiàn)，較HBsAg消失早意義體內(nèi)HBV復(fù)制、傳染性強(qiáng)的標(biāo)志急性乙型肝炎的輔助診斷判斷預(yù)后的指標(biāo)：HBeAg轉(zhuǎn)陰，表示HBV復(fù)制減少或終止，預(yù)后好；若HBeAg持續(xù)陽(yáng)性，則預(yù)后不良，易轉(zhuǎn)為慢性抗-HBe

HBeAg消失后出現(xiàn)無(wú)癥狀HBV攜帶者及非活動(dòng)期慢性肝炎患者表示HBV在體內(nèi)復(fù)制減少或終止，傳染性減弱或消失HBcAg

不能從血清中直接檢出

Dane顆粒經(jīng)去垢劑處理HBcAg釋放檢測(cè)抗-HBc

非中和抗體、分IgM和IgG

主要見(jiàn)于慢性感染和既往感染抗-HBc

IgM

通常在出現(xiàn)癥狀時(shí)即可檢出，一般持續(xù)約6個(gè)月，提示HBV復(fù)制，是急性感染的重要指標(biāo)，也是慢性活動(dòng)性肝炎的重要標(biāo)志抗-HBc

IgG

在抗-HBc

IgM下降及消失后出現(xiàn)，可伴隨感染者終生存在臨床機(jī)構(gòu)一般常規(guī)檢測(cè)抗-HBc

，但檢測(cè)抗-HBc

IgM相對(duì)較少（乙肝6項(xiàng)）?？?HBc

IgM≠抗-HBc，檢測(cè)試劑盒也不同，需正確區(qū)分IgManti-HBcHBsAg0481216202428323652100急性HBV感染的血清學(xué)變化暴露后時(shí)間滴度HBeAganti-HBeSymptomsanti-HBsTotalanti-HBcHBVDNAWindowPeriodIgManti-HBcTotalanti-HBcHBsAgAcute(6months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0481216202428323652滴度暴露后時(shí)間慢性HBV感染的血清學(xué)變化HBV感染血清學(xué)常見(jiàn)模式臨床及流行病學(xué)意義HBsAg抗-HBs抗-HBcIgG

IgMHBeAg抗-HBe潛伏期末期+﹣﹣﹣+/﹣﹣急性乙肝，病毒長(zhǎng)期攜帶+﹣+++﹣HBsAg陰性的急性感染﹣﹣﹣+﹣﹣感染消除，抗-HBs尚未出現(xiàn)﹣﹣+﹣﹣﹣健康攜帶者+﹣++/-﹣+慢性乙肝，病毒長(zhǎng)期攜帶+-++/-+-HBV近期感染，恢復(fù)期﹣+++/-﹣+HBV既往感染，已恢復(fù)﹣+/-+﹣﹣﹣﹣乙肝疫苗接種﹣+﹣﹣﹣﹣17生物化學(xué)檢測(cè)1HBV血清標(biāo)志物的檢測(cè)2HBV分子生物學(xué)診斷3

HBV感染的實(shí)驗(yàn)室檢查乙型肝炎的生物化學(xué)檢測(cè)主要指標(biāo)：ALT,AST,血清白蛋白，球蛋白血清膽紅素，堿性磷酸酶其它18方法學(xué)的發(fā)展ELISA：靈敏性高，成本低，適用于普通病人篩查；膠體金免疫層析法(金標(biāo)法)：簡(jiǎn)便易行，可用于急診病人快速檢測(cè)或無(wú)償獻(xiàn)血人員粗篩檢測(cè)HBsAg；化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)：價(jià)格昂貴，可用于HBVMs為臨界值的病人的確證；在評(píng)價(jià)抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答、療效和判斷預(yù)后方面有重要意義。新增檢測(cè)指標(biāo)Pre–S1抗原等192.HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)HBV基因型和基因變異研究：必要性主要方法HBV-DNA病毒載量測(cè)定：PCR結(jié)合熒光探針技術(shù)病毒復(fù)制水平最可靠，最直接的證據(jù)，與傳染性和疾病進(jìn)展密切相關(guān)；主要用于HBV感染的判斷，治療適應(yīng)癥的選擇及抗病毒療效的判斷。HBV耐藥突變的檢測(cè)3.HBV分子生物學(xué)檢測(cè)病毒基因突變疾病進(jìn)展臨床表現(xiàn)對(duì)干擾素應(yīng)答耐藥變異生化學(xué)改善HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換HBVDNA清除急性乙型肝炎慢性乙型肝炎肝硬化(LC)肝細(xì)胞癌(HCC)21HBV基因型/基因亞型乙肝病毒基因分析技術(shù)路線HBVDNA提取PCR擴(kuò)增相應(yīng)區(qū)段PCR產(chǎn)物直接測(cè)序生物信息學(xué)分析與數(shù)據(jù)信息挖掘血清與資料收集22MWIEDFYMS195196I19821015816499121124137138139107149147GD--S-S-S-SS-SS-SLoop1of“a”determinantLoop2of“a”determinant145144ERAlphahelicase

Vaccineescapemutant

Lamivudineresistantmutant

F(苯丙)Y(酪)E(谷)D(天冬)I(異白)M(蛋)W(色)S(絲)M(蛋)I(異白)

D(天冬)E(谷)G(甘)R(精)

2013中央補(bǔ)助地方項(xiàng)目抗-HBc

IgM

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)ELISA（最常用，定性）免疫層析法（膠體金或硒標(biāo)法）發(fā)光免疫分析（定量)HBV感染的血清學(xué)診斷方法抗-HBc

IgM檢測(cè)方法：ELISA/發(fā)光免疫分析法，本項(xiàng)目采用ELISA方法ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室配備基本儀器酶標(biāo)儀洗板機(jī)移液器干式恒溫箱恒溫水浴箱或-20℃低溫冰箱普通冰箱抗-HBcIgM

酶免檢測(cè)收樣：血清標(biāo)本收樣登記表：抗-HBc

IgM1:1000標(biāo)本檢測(cè)登記表.doc（縣級(jí)需檢測(cè)）慢性乙型肝炎血標(biāo)本送檢表.doc

（縣級(jí)不必檢測(cè)）樣品整理、編號(hào)樣本保存：標(biāo)本宜新鮮時(shí)檢測(cè)，若5天內(nèi)檢測(cè)，可使用冰箱2～8℃保存，超過(guò)1周測(cè)定，應(yīng)-20℃保存檢測(cè)項(xiàng)目：抗-HBc

IgM檢測(cè)時(shí)限：每月10日前完成上月標(biāo)本檢測(cè)檢測(cè)試劑：省統(tǒng)一購(gòu)置，分次到省疾控免疫所肝炎實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)取。試劑儲(chǔ)存：2～8℃保存，注意效期結(jié)果反饋抗-HBc

IgM1:1000標(biāo)本檢測(cè)登記表（乙肝監(jiān)測(cè)項(xiàng)目用）.

?。ㄖ陛犑校?/p>

市

縣（市、區(qū)）試劑生產(chǎn)廠家：血標(biāo)本編號(hào)報(bào)告卡編號(hào)姓名性別送檢日期檢測(cè)日期檢測(cè)結(jié)果

慢性乙型肝炎血標(biāo)本送檢表（乙肝監(jiān)測(cè)項(xiàng)目用）.

?。ㄖ陛犑校?/p>

市

縣（市、區(qū)）標(biāo)本送檢人簽字：

標(biāo)本接受人員簽字：

血標(biāo)本編號(hào)報(bào)告卡編號(hào)姓名性別采樣日期送檢日期乙型肝炎病毒核心IgM抗體診斷試劑盒（ELISA法）操作說(shuō)明原理:采用捕獲法ELISA原理，用抗人μ鏈捕獲待測(cè)血清中特異性IgM，洗板侯加入抗原結(jié)合酶進(jìn)行二次溫育。當(dāng)樣品中存在核心IgM抗體時(shí)，形成”抗μ鏈-IgM抗體-抗原結(jié)合酶“復(fù)合物。最后加底物顯色。標(biāo)本要求：血清或血漿，樣本量足夠；污染、標(biāo)本量不足、嚴(yán)重溶血標(biāo)本不宜作此項(xiàng)檢測(cè)試劑生產(chǎn)廠家：北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司包裝規(guī)格：48人份/盒試劑盒組成：包被反應(yīng)板，酶標(biāo)試劑，陽(yáng)性對(duì)照血清，陰性對(duì)照血清，濃縮洗滌液，顯色劑A液，顯色劑B液，終止液，封口膜，密封袋。試劑儲(chǔ)存條件及有效期：2-8°C保存操作步驟1、平衡：將試劑盒取出，平衡至室溫30min，微孔板開(kāi)封后，余者及時(shí)以自封袋封存。標(biāo)本也需室溫平衡30min。

2、配液：濃縮洗滌液配制前充分搖勻（如有晶體應(yīng)充分溶解），濃縮洗滌液和蒸餾水或去離子水按1：19稀釋后使用。3、編號(hào)：將微孔條固定于支架，按序編號(hào)，設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照各2孔和空白對(duì)照1孔（雙波長(zhǎng)可不設(shè)空白孔）。4、稀釋：將待測(cè)標(biāo)本用生理鹽水做1：1000稀釋（質(zhì)控品及陰陽(yáng)性對(duì)照不稀釋）5、加樣：分別在相應(yīng)孔中加入待測(cè)樣品或陰陽(yáng)性對(duì)照100ul，6、溫育：封板、37℃溫育30分鐘。7、洗滌：5遍，最后1次盡量扣干8、加酶：每孔加酶標(biāo)試劑100ul，空白孔除外9、溫育：同步驟610、洗滌：同步驟711、顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50ul，混勻，37℃避光顯色15min12、測(cè)定：每孔加入終止液50ul，混勻，10min內(nèi)測(cè)定結(jié)果。設(shè)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm（建議用雙波長(zhǎng)450/600-650nm檢測(cè)），用空白孔調(diào)零后測(cè)定各孔A值。參考范圍陰性對(duì)照的正常范圍：正常情況下，陰性對(duì)照孔A值≤0.1（若有1孔陰性對(duì)照孔A值大于0.1應(yīng)舍棄該空，弱兩孔或以上陰性對(duì)照孔A值都大于0.1，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照的正常范圍：正常情況下，陽(yáng)性對(duì)照孔A值≥0.8結(jié)果判定臨界值（CUTOFF)計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔A均值×2.1陽(yáng)性判定：樣品A值≥臨界值（CUTOFF)判為陽(yáng)性陰性判定：樣品A值≤臨界值（CUTOFF)判為陰性注意事項(xiàng)待測(cè)樣品要求冷凍樣品實(shí)驗(yàn)前需溶解并混勻，使用前請(qǐng)將樣品室溫平衡30分鐘以上。如樣品有雜質(zhì)、渾濁現(xiàn)象，檢測(cè)前應(yīng)3500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上清液檢測(cè)續(xù)待測(cè)樣品1：1000稀釋方法-非常關(guān)鍵稀釋液為0.9%生理鹽水。稀釋方法:盡可能連續(xù)倍比稀釋（1：10，連續(xù)3次）不建議直接在1ml生理鹽水中加入1μl血清,此種操作容易出現(xiàn)誤差。續(xù)實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行。每次均需設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照原始記錄：完整的實(shí)驗(yàn)原始記錄，如試劑批號(hào)，結(jié)果原始OD值，并保存好原始記錄。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將結(jié)果及時(shí)填寫在抗-HBc

IgM1:1000標(biāo)本檢測(cè)登記表.doc，注意表中請(qǐng)?jiān)黾觾牲c(diǎn)，試劑批號(hào)和結(jié)果原始S/CO值:s為標(biāo)本OD值，CO為該批標(biāo)本檢測(cè)判定的臨界值，二者的比值?？?HBc

IgM1:1000標(biāo)本檢測(cè)登記表（乙肝監(jiān)測(cè)項(xiàng)目用）.

省（直轄市）

市

縣（市、區(qū)）試劑生產(chǎn)廠家：試劑批號(hào)：

血標(biāo)本編號(hào)報(bào)告卡編號(hào)姓名性別送檢日期檢測(cè)日期檢測(cè)結(jié)果S/CO注：1.“報(bào)告卡編號(hào)”為NNDRS中自動(dòng)生成的病例編號(hào)（18位）；2.“檢測(cè)結(jié)果”在相應(yīng)位置填寫：1=陽(yáng)性；2=陰性；3=未檢測(cè)。檢測(cè)單位：

檢測(cè)人員：續(xù)試劑使用試劑在使用之前室溫平衡30分鐘。國(guó)產(chǎn)試劑為定性試劑，不能作為定量試劑使