犐犆犛１１．２２０

犅４１

中華人民共和國國家標準

犌犅／犜２２３３３—２００８

日本乙型腦炎病毒

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗方法

犚犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀犳狅狉

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２００８０８２２發(fā)布２００８１２０１實施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局

發(fā)布

中國國家標準化管理委員會

書

犌犅／犜２２３３３—２００８

前言

本標準的附錄Ａ為規(guī)范性附錄。

本標準由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。

本標準由全國動物防疫標準化技術(shù)委員會歸口。

本標準起草單位：農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心。

本標準主要起草人：王宏偉、孫明、王傳彬、陳西釗、田克恭。

Ⅰ

書

犌犅／犜２２３３３—２００８

日本乙型腦炎病毒

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗方法

１范圍

本標準規(guī)定了日本乙型腦炎病毒核酸的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗的技術(shù)要求。

本標準適用于動物腦組織中日本乙型腦炎病毒核酸的檢測。

２試劑

２．１變性液（見第Ａ．１章）。

２．２２ｍｏｌ／Ｌ乙酸鈉溶液（ｐＨ４．０）。

２．３酚三氯甲烷異戊醇混合液（見第Ａ．２章）。

２．４２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ。

２．５８ｍｍｏｌ／Ｌ上下游引物混合液（引物序列見第Ａ．３章）。

２．６１０倍ＰＣＲ緩沖液。

２．７１％溴化乙錠（ＥＢ）溶液。

２．８ＴＡＥ電泳緩沖液。

２．９１％瓊脂糖凝膠。

２．１０上樣緩沖液（見第Ａ．４章）。

２．１１其他試劑：１０Ｕ／μＬＡＭＶ反轉(zhuǎn)錄酶、１００ｂｐＤＮＡ分子質(zhì)量標準物、５０Ｕ／μＬＲＮＡ酶抑制劑、

５Ｕ／μＬ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、異丙醇、７５％乙醇溶液、２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化鎂溶液、ＤＥＰＣ處理過的無菌雙

蒸水。

３實驗室條件

３．１實驗室級別要求

實驗室必須為生物安全Ⅲ級（ＢＳＬ３級）實驗室。

３．２實驗室分區(qū)

ＲＴＰＣＲ試驗區(qū)域分反應(yīng)液配制區(qū)（配液區(qū)）、核酸提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序為配液區(qū)→

核酸提取區(qū)→擴增區(qū)→電泳區(qū)。嚴禁器材和試劑倒流。

３．３實驗室應(yīng)配備的儀器及耗材

３．３．１儀器：分析天平、高速離心機、真空干燥器、ＰＣＲ擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫

外分析儀）、液氮罐或－７０℃冰箱、微波爐、組織研磨器、－２０℃冰箱、水浴鍋、可調(diào)移液器（最大量程分

別為２μＬ、２０μＬ、２００μＬ、１０００μＬ）。

３．３．２耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、１０ｍＬ一次性注射器、１．５ｍＬ滅菌離心管、０．２ｍＬ薄壁ＰＣＲ

管、瓊脂糖、５００ｍＬ