犐犆犛１１．２２０

犅４１

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

犌犅／犜２２３３３—２００８

日本乙型腦炎病毒

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法

犚犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀犳狅狉

犑犪狆犪狀犲狊犲犅犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊

２００８０８２２發(fā)布２００８１２０１實(shí)施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局

發(fā)布

中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

書

犌犅／犜２２３３３—２００８

前言

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄Ａ為規(guī)范性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王宏偉、孫明、王傳彬、陳西釗、田克恭。

Ⅰ

書

犌犅／犜２２３３３—２００８

日本乙型腦炎病毒

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法

１范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了日本乙型腦炎病毒核酸的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)的技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物腦組織中日本乙型腦炎病毒核酸的檢測。

２試劑

２．１變性液（見第Ａ．１章）。

２．２２ｍｏｌ／Ｌ乙酸鈉溶液（ｐＨ４．０）。

２．３酚三氯甲烷異戊醇混合液（見第Ａ．２章）。

２．４２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ。

２．５８ｍｍｏｌ／Ｌ上下游引物混合液（引物序列見第Ａ．３章）。

２．６１０倍ＰＣＲ緩沖液。

２．７１％溴化乙錠（ＥＢ）溶液。

２．８ＴＡＥ電泳緩沖液。

２．９１％瓊脂糖凝膠。

２．１０上樣緩沖液（見第Ａ．４章）。

２．１１其他試劑：１０Ｕ／μＬＡＭＶ反轉(zhuǎn)錄酶、１００ｂｐＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物、５０Ｕ／μＬＲＮＡ酶抑制劑、

５Ｕ／μＬ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、異丙醇、７５％乙醇溶液、２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化鎂溶液、ＤＥＰＣ處理過的無菌雙

蒸水。

３實(shí)驗(yàn)室條件

３．１實(shí)驗(yàn)室級(jí)別要求

實(shí)驗(yàn)室必須為生物安全Ⅲ級(jí)（ＢＳＬ３級(jí)）實(shí)驗(yàn)室。

３．２實(shí)驗(yàn)室分區(qū)

ＲＴＰＣＲ試驗(yàn)區(qū)域分反應(yīng)液配制區(qū)（配液區(qū)）、核酸提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→

核酸提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。

３．３實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備的儀器及耗材

３．３．１儀器：分析天平、高速離心機(jī)、真空干燥器、ＰＣＲ擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫

外分析儀）、液氮罐或－７０℃冰箱、微波爐、組織研磨器、－２０℃冰箱、水浴鍋、可調(diào)移液器（最大量程分

別為２μＬ、２０μＬ、２００μＬ、１０００μＬ）。

３．３．２耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、１０ｍＬ一次性注射器、１．５ｍＬ滅菌離心管、０．２ｍＬ薄壁ＰＣＲ

管、瓊脂糖、５００ｍＬ