益生菌制劑對雛雞盲腸菌群的部分作用機制,畜牧獸醫(yī)論文在畜牧業(yè)生產(chǎn)經(jīng)過中,利用抗生素治療和預防疾病帶來的種種弊端逐步被人們所認識,2006年歐盟決定禁止使用任何抗生素作為飼料添加劑。益生菌作為一類能通過調(diào)控生物體微生態(tài)平衡進而有效促進宿主健康生長的活微生物制劑,一直被以為是抗生素的最佳替代者之一。關于對雛雞腸道菌群的研究已有較多,但是關于益生菌和抗生素對肉雛雞盲腸菌群發(fā)育規(guī)律的影響作用還鮮有報道。本研究以屎腸球菌和金霉素為試驗材料,通過對不同日齡肉雛雞盲腸內(nèi)容物的16SrDNAV3區(qū)進行PCR-DGGE指紋圖譜比擬分析,從不同角度研究益生菌制劑的部分作用機制以及日糧中添加抗生素的可能影響。1、材料與方式方法1.1試驗材料與試驗動物試驗材料為華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學重點實驗室專利菌株(專利號:ZL201810452087.2)屎腸球菌HDRsEf1株,湖北華大瑞爾科技有限公司生產(chǎn),每克菌粉的活菌數(shù)30億。試驗動物為1日齡健康白羽肉雞科寶500,購自湖北宜昌正大有限公司。1.2試驗設計與樣品采集1)屎腸球菌定植動物試驗。選用1日齡健康白羽肉雞80只隨機分成對照組(玉米-豆粕基礎日糧)和益生組(添加300g屎腸球菌菌粉/1000kg),每組分別在1、3、5、7、9、11日齡時頸靜脈放血處死5只雛雞,在超凈臺內(nèi)快速采集盲腸內(nèi)容物并混合,置4℃冰箱備用。2)屎腸球菌和抗生素對雛雞腸道菌群的影響試驗。試驗選用1日齡新生白羽肉雞180只,隨機分成對照組(玉米-豆粕基礎日糧)、益生組(添加300g屎腸球菌菌粉/1000kg)和抗生素組(添加50mg金霉素/kg)。每組3個重復,每個重復20只雞。試驗周期為42d,每組分別在7、14、21、28、35、42日齡時頸靜脈放血處死6只試驗雞,在超凈臺內(nèi)快速采集盲腸內(nèi)容物,將每個組的6只雛雞內(nèi)容物混合,置4℃冰箱備用。1.3細菌總DNA的提取參照文獻,采用QIAampDNAStoolMiniKit,根據(jù)操作手冊提取細菌總DNA。用核酸濃度測定儀測定總DNA濃度,置-20℃保存?zhèn)溆谩?.4RT-PCR法檢測盲腸中屎腸球菌、大腸桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量實時熒光定量PCR所用的引物見表1。檢測屎腸球菌數(shù)量的熒光定量PCR反響條件:95℃預變性30s;95℃變性5s,60℃延伸30s,40個循環(huán)。檢測大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的熒光定量PCR反響條件:95℃預變性30s;95℃變性5s,55℃退火20s,72℃延伸30s,40個循環(huán)。每次熒光定量PCR循環(huán)結(jié)束后溶解曲線從65℃逐步升到95℃。熒光定量PCR體系的最終體積控制在20L,反響試劑均按PremixExTaqTM試劑講明書的推薦量添加。1.5基因組特異性片段V3區(qū)的擴增為了檢測各組腸道菌群的變化情況,用引物GC341f(5-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATTACCGCGGCTGCTGG-3)和519r(5-CCTACGGGAGGCAGCAG-3)擴增16SrRNA的V3區(qū)片段,擴增條件是94℃預變性5min;94℃變性30s,55℃退火20s,72℃延伸30s,35個循環(huán);最后72℃延伸10min。PCR反響體系(25L):2PCRmix12.5L,上下游引物(10pmol/L)各1L,DNA模板2L,ddH2O補足至25L。1.6基因組特異性片段V3區(qū)的變性梯度凝膠電泳(DGGE)使用Bio-RadDcode進行DGGE凝膠電泳。變性劑梯度范圍為38%~55%,100%的變性劑包含7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺。電泳在恒溫60℃條件下1TAE緩沖液中進行,先200V預電泳10min,然后65V電壓電泳16h。參照文獻[7]方式方法用硝酸銀染色,對完成顯色后的凝膠拍照,再用相應軟件對圖譜進行分析。1.7數(shù)據(jù)分析采用UPGMA進行聚類分析,以香農(nóng)多樣性指數(shù)H表示菌群多樣性的高低,SPSS18.0進行PCA分析和顯著性差異分析。2、結(jié)果與分析2.1益生性屎腸球菌HDRsEf1株在雛雞腸道菌群定植確實定如此圖1所示,隨著雛雞日齡的增加,益生菌組中雛雞盲腸中的屎腸球菌的數(shù)量逐步增加,到第5日齡時基本到達穩(wěn)定,而對照組的屎腸球菌的數(shù)量在5日齡以后逐步降低,講明該株屎腸球菌HDRsEf1能夠在雛雞盲腸內(nèi)定植,并且在5日齡時就基本到達穩(wěn)定。2.2大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的檢測由表2可見,飼料中添加屎腸球菌HDRsEF1和抗生素能夠顯著減少21日齡時雛雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量(P0.05),而在42日齡時益生菌組和抗生素組中的大腸桿菌的數(shù)量都有所下降,但差異不明顯。同時,飼料中添加屎腸球菌HDRsEF1能夠顯著增加雛雞盲腸中乳酸桿菌的數(shù)量,在42日齡時益生菌組與對照組和抗生素相比差異顯著(P0.05),在21日齡時差異不顯著。2.3DGGE圖譜的分析與處理1)DGGE圖譜的聚類分析結(jié)果。聚類分析結(jié)果(圖2)主要有2個分支,7日齡雛雞盲腸微生物菌群與其他日齡的距離較遠,而從14日齡到42日齡微生物菌群比擬穩(wěn)定,講明從7日齡到14日齡時微生物菌群產(chǎn)生了明顯的變化。2)DGGE圖譜的類似性和多樣性分析結(jié)果。通過比擬各處理組雛雞在7日齡和14日齡、14日齡和21日齡、21日齡和28日齡、28日齡和35日齡以及35日齡和42日齡的盲腸微生物菌群之間的類似性,來評價腸道菌群的穩(wěn)定程度,類似度越高則講明腸道菌群的變化越小,穩(wěn)定度越高。由表3能夠看出,除了7日齡與14日齡,益生菌組的其他相鄰日齡之間的類似度指數(shù)均高于對照組和抗生素組,并且差異顯著(P0.05),講明在14日齡以后,益生菌組的腸道菌群相對于另外2組維持在比擬穩(wěn)定的狀態(tài)。在3個處理組中,抗生素組在14到35日齡時的類似性指數(shù)均低于對照組和抗生素組,講明抗生素的添加會降低腸道菌群的穩(wěn)定性。由圖3可見,3個不同處理組的雛雞盲腸微生物菌群的多樣性指數(shù)隨日齡的增加均逐步增大,各組之間的差異不顯著,講明益生菌和抗生素的添加并不會影響腸道菌群的多樣性指數(shù)。3)DGGE圖譜的主成分分析。對DGGE圖譜的主成分分析結(jié)果與聚類分析的結(jié)果一致,如此圖4所示。7日齡樣品與其他日齡樣品的距離較遠,位于矩形方框的下部,講明7日齡盲腸菌群與其他日齡的差異較大。而14、28日齡和35、42日齡分居矩形方框上部的左右側(cè)。3、討論3.1屎腸球菌在雛雞盲腸菌群的定植益生菌在腸道內(nèi)的粘附定植是其發(fā)揮生理作用的前提和基礎。本文用RT-PCR技術(shù)來檢測屎腸球菌HDRsEf1在盲腸的定植情況,檢測的結(jié)果顯示對照組在3日齡到7日齡時屎腸球菌的數(shù)量大致一樣,Lu等利用分子生物學的方式方法研究發(fā)現(xiàn),在肉雞3日齡和7日齡的盲腸菌群中檢測到的屎腸球菌拷貝數(shù)一樣,與本研究對照組的檢測結(jié)果一致。而益生菌組中的屎腸球菌的數(shù)量隨著飼喂時間的增加而逐步升高,在雛雞5日齡時數(shù)量就基本到達穩(wěn)定,講明該屎腸球菌HDRsEf1與雛雞的盲腸粘膜的粘附性好,能夠在盲腸穩(wěn)定存活。3.2益生性屎腸球菌和抗生素對雛雞盲腸大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的影響益生菌進入動物胃腸道后,能夠通過產(chǎn)生抑菌物質(zhì)或者產(chǎn)酸來抑制某些潛在有害菌和對酸性敏感的病原菌的生長,維持腸道菌群的平衡。本研究利用不需培養(yǎng)計數(shù)的RT-PCR的分子生物學方式方法定量檢測了腸道細菌的數(shù)量,發(fā)現(xiàn)益生菌的添加能夠顯著降低大腸桿菌的數(shù)量,增加乳酸桿菌的數(shù)量。但是該方式方法相當于傳統(tǒng)的細菌計數(shù)法,不但省時省力,且能有效提高檢測的靈敏度,實現(xiàn)快速定量檢測。通過比擬益生菌組和抗生素組發(fā)現(xiàn),日糧中添加抗生素,在抑制大腸桿菌數(shù)量生長的同時也抑制了乳酸桿菌的生長,而益生菌的添加則會促進乳酸桿菌的生長,從這一點來看益生菌組的效果要優(yōu)于抗生素組。3.3PCR-DGGE指紋圖譜的分析PCR-DGGE聚類分析的結(jié)果和主成分分析的結(jié)果一致,益生性屎腸球菌和金霉素的添加并不會影響雛雞盲腸微生物菌群的正常發(fā)育。Lu等[9]研究發(fā)現(xiàn)肉雞在3~7日齡、14~28日齡及49日齡時的盲腸腸道菌群構(gòu)造有明顯的差異。從本研究的聚類分析和主成分分析結(jié)果能夠看出,早期肉雛雞盲腸菌群在7日齡時與在14~42日齡時的差異較大,講明早期雛雞盲腸菌群從7日齡到14日齡為一個過渡期,從14日齡到42日齡為一個相對穩(wěn)定期,兩者研究結(jié)果基本一致。該結(jié)果提示,假如在肉雛雞7日齡之前飼喂有利于盲腸腸道菌群健康生長的益生菌或某種物質(zhì),將有利于雛雞盲腸菌群更有效地到達穩(wěn)定狀態(tài),能減少盲腸菌群在過渡時期給肉雛雞帶來的各種應激反響。通過比擬各處理組相鄰周齡之間的PCR-DGGE指紋圖譜的類似性指數(shù)能夠看出,益生菌組在7~14日齡時最低,而在之后均高于對照組和抗生素組,講明在肉雛雞盲腸微生物菌群的發(fā)育經(jīng)過中,益生菌的添加能更有效地促進腸道微生物菌群進入到穩(wěn)定狀態(tài)并且維持穩(wěn)定。而抗生素組的類似性指數(shù)在過渡期7~14日齡要高于其他2組,在之后的穩(wěn)定期14~35日齡內(nèi)要低于其他2組,講明抗生素金霉素的添加并沒有有效促進盲腸微生物菌群進入穩(wěn)定狀態(tài),反而抑制了微生物菌群進入和維持穩(wěn)態(tài)。以下為參考文獻：[1]王曉霞,易中華,計成,等.果寡糖和枯草芽孢桿菌對肉雞腸道菌群數(shù)量、發(fā)酵糞中氨氣和硫化氫