預(yù)處理--細胞的分離與破碎

2.1細胞分離

重力沉降

離心沉降

過濾

重力沉降

重力沉降是化工過程中常用的氣固、液固和液液分離手段，在生化分離過程中亦有一定程度的應(yīng)用。以液固沉降為例，重力沉降過程中固體顆粒受到重力、浮力和摩擦阻力的作用?？紤]球形的固體顆粒，則當(dāng)浮力、摩擦阻力和重力達到平衡時，固體顆粒勻速沉降，沉降速度為

上式為球形粒子的Stokes沉降速度，、、和分別表示粒徑、固體顆粒密度、液體密度和重力加速度，為重力沉降速度，為液體粘度。菌體和動植物細胞的重力沉降雖然簡便易行，但菌體細胞體積很小，沉降速度很慢。因此，實用上需使菌體細胞聚并成較大凝聚體顆粒后進行沉降操作，提高沉降速度。

離心沉降

離心類別離心沉降速度離心分離法離心分離設(shè)備

離心機的種類和適用范圍離心沉降速度

離心設(shè)備的一個重要技術(shù)指標(biāo)是其所能達到的離心力與重力的比值，稱為分離因數(shù)。分離因數(shù)是衡量離心程度的參數(shù)，用Z表示式中，r為離心半徑，即從旋轉(zhuǎn)軸心到沉降顆粒的距離，N為離心機的轉(zhuǎn)數(shù)(s-1)。離心沉降和重力沉降只是對沉降的作用力不同，因此，將式(1)中的g用Zg代替，可得離心沉降速度Vs為或離心分離法差速離心區(qū)帶離心

差速離心分級差速離心(Differentialcentrifugation)是生化工業(yè)中最常用的離心分離方法。以菌體細胞的收集或除去為目的的固液離心分離是分級離心操作的一種特殊情況，即為一級分級分離。操作中，根據(jù)實際物料的特點(目標(biāo)產(chǎn)物和其他組分的性質(zhì)和相互作用等)、分離的目的和所需分離的程度，選擇適當(dāng)?shù)牟僮鳁l件(離心轉(zhuǎn)數(shù)和時間)，可使料液中的不同組分得到分級分離。

差速離心

差速離心是生化工業(yè)中常用離心分離方法。以菌體細胞的收集或除去為目的的固液離心分離，是分級離心操作的一種特殊情況，即為一級分級分離。2.2.3.2離心分離法主要菌體和細胞的離心分離蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)區(qū)帶離心

區(qū)帶離心(Zonalcentrifugation)是生化研究中的重要分離手段，根據(jù)離心操作條件不同，分為差速區(qū)帶離心(Ratezonaldensitygradientsedimentation)平衡區(qū)帶離心(Isopycnicdensitygradientsedimentation)

梯度離心兩種區(qū)帶離心法均事先在離心管中用某種低分子溶質(zhì)(如蔗糖、甘油等溶液)調(diào)配好密度梯度，在密度梯度之上加待處理的料液后進行離心操作。區(qū)帶離心的密度梯度一般可用蔗糖配制。事先調(diào)配不同濃度(密度)的蔗糖溶液，然后在離心管中依濃度從大到小層層加入即可。將一定濃度的蔗糖溶液經(jīng)一定時間的高速離心后可制成連續(xù)的蔗糖密度梯度。區(qū)帶離心法可用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離純化，但處理量小，一般僅限于實驗室水平。

密度梯度離心（densitygradient）

生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質(zhì)有蔗糖、氯化銫等。滴加樣品蔗糖濃度離心管蔗糖密度梯度密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的應(yīng)用1、核酸密度的測定=o+4.2

2(2-02)10-102、測定DNA中G-C之含量

Rolfe-Meselson公式：=0.100xG-C+1.6583、溶液中核酸構(gòu)象的研究：單鏈DNA雙鏈DNA蛋白質(zhì)雙鏈DNARNA4、核酸的制備

氯化銫密度梯度超離心經(jīng)染料-氯化銫密度梯度超離心后，質(zhì)粒DNA及各種雜質(zhì)的分布超螺旋DNA閉環(huán)質(zhì)粒DNA開環(huán)質(zhì)及線型DNA蛋白質(zhì)石蠟油離心分離設(shè)備離心機是生化實驗室及生化工業(yè)廣泛使用的分離設(shè)備。實驗室用離心機以離心管式轉(zhuǎn)子離心機為主，離心操作為間歇式。

工業(yè)離心分離設(shè)備中，較為常用的有管式和碟片式兩大類。

管式離心機碟片式離心機各種轉(zhuǎn)子區(qū)帶轉(zhuǎn)子分析轉(zhuǎn)子過濾

過濾速度過濾設(shè)備

過濾操作

織物狀介質(zhì)，棉花、石棉、蠶絲、麻、羊毛及各種人造纖維與金屬絲等多孔陶瓷介質(zhì)，此為特殊的介質(zhì)，低溫?zé)疲哂写罅课⒓毧椎赖臑V管或濾板（其他多孔材料，PE等）膜分離介質(zhì)，微濾分離等

采用合適的多孔性過濾介質(zhì)，可以過濾截留菌體、細胞和碎片等懸浮液中的固體離子。2.2.2過濾

對具體過濾處理的不同對象，應(yīng)根據(jù)下列因素，選取合適的過濾設(shè)備：(1)料液的粘度、腐蝕性；(2)固態(tài)懸浮物的粒度、濃度以及變形性等；(3)目的產(chǎn)物是液體部分還是懸浮固體等。

過濾速度過濾操作一般以壓力差為透過推動力，只靠重力不能達到足夠大的透過速度。過濾操作中固形成分被過濾介質(zhì)截留，在介質(zhì)表面形成濾餅。濾液的透過阻力來自兩個方面，即過濾介質(zhì)和介質(zhì)表面不斷堆積的濾餅。提高過濾速度和過濾質(zhì)量是過濾操作的目標(biāo)。由于濾餅阻力是影響過濾速度的主要因素，因此在過濾操作以前，一般要對濾液進行絮凝或凝聚等預(yù)處理。改變料液的性質(zhì)，降低濾餅的阻力。

過濾設(shè)備

內(nèi)裝微孔濾膜進液口出液口微孔濾膜濾器2.2.2.3常用過濾設(shè)備生化分離中，工業(yè)規(guī)模過濾設(shè)備主要有加壓葉濾機、板框過濾機、旋轉(zhuǎn)真空過濾機。過濾板濾框洗滌板板框式壓濾機裝置及濾板與濾框的構(gòu)造1鈕2鈕3鈕加壓葉濾機加壓葉濾機占地面積小，單位容積過濾面積大。相對于板框過濾機，葉濾機在密封條件下過濾，適于無菌操作；但需要足夠的空間來更換濾葉和清除濾餅，發(fā)酵工廠中常用于啤酒過濾，即垂直葉片硅藻土過濾機。

板框式過濾機：適用于要求濾餅較干的場合，不適用于含揮發(fā)性有毒物質(zhì)或有生物危害的場合。

思考題1、何謂沉降2、沉降與離心的異同3、離心設(shè)備可分為哪兩大類4、常用的離心沉降設(shè)備有哪些5、常用的離心過濾設(shè)備有哪些

胞外產(chǎn)物：微生物代謝產(chǎn)物大多分泌到細胞外，如大多數(shù)小分子代謝物、胞外酶、抗生素、多糖等，直接進行固液分離，即可進行濾清液的分離。

胞內(nèi)產(chǎn)物：某些目的產(chǎn)物不能分泌到細胞外，留在細胞內(nèi)部，如大多數(shù)酶蛋白、類脂和部分抗生素等。隨著重組DNA技術(shù)發(fā)展，許多有重要價值的生物產(chǎn)品應(yīng)運而生，如胰島素、干擾素、白細胞介素-2等，基因在宿主細胞內(nèi)克隆表達成為基因工程產(chǎn)品，其中許多存在于胞內(nèi)。

分離提取胞內(nèi)產(chǎn)物時，首先必須將細胞破碎，使產(chǎn)物得以釋放，才能進一步提取。

2.2細胞破碎2.1.1細胞壁的組成與結(jié)構(gòu)動物細胞無細胞壁，只有細胞膜，易于破碎。植物細胞和微生物細胞的細胞膜外還有一層堅固的細胞壁，破碎較困難。微生物細胞的細胞壁固定細胞外形，保護細胞免受機械損傷或滲透壓破壞。細胞膜主要由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成，二者之和占細胞膜構(gòu)成成分的80-100%厚度較薄(7～10nm)，易受滲透壓沖擊而破碎。細胞破碎阻力主要來自細胞壁。

原核細胞－組成原核生物的細胞。沒有明顯可見細胞核，也沒有核膜和核仁，進化地位較低。原核生物均為單細胞生物，包括：細菌(狹義)、放線菌、藍細菌、支原體、立克次氏體和衣原體。真核細胞－含有真核（被核膜包圍的核）的細胞。包括動植物以及微小的原生動物、單細胞海藻、真菌、苔蘚等。真核細胞結(jié)構(gòu)生物產(chǎn)物可能存在于細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)以及線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細胞器中。破碎細胞的目的就是使細胞壁和細胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，釋放其中的目標(biāo)產(chǎn)物。細胞外層結(jié)構(gòu)

2.1.2細胞破碎原理細胞破碎方法可分成兩大類，一是機械法，二是非機械法，或是兩者的結(jié)合。

機械法有珠磨法、高壓均質(zhì)法、超聲破碎法、X-press法等；由于消耗的機械能轉(zhuǎn)為熱量會使溫度上升，大多需冷卻以防止生物品受熱破壞。非機械法有酶溶法、化學(xué)法、物理法和干燥法等。

機械法中細胞所受的機械作用力主要有壓縮力和剪切力。化學(xué)破碎利用化學(xué)或生化試劑(酶)改變細胞壁或細胞膜結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)的溶解速率；或者完全溶解細胞壁后，在滲透壓作用下使細胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)。細胞破碎和產(chǎn)物釋放原理

胞內(nèi)產(chǎn)物釋放速率模型

細胞破碎法

機械破碎化學(xué)和生物化學(xué)滲透物理滲透法機械破碎高壓勻漿珠磨撞擊破碎超聲波破碎機械破碎機械破碎處理量大、破碎效率高、速度快，是工業(yè)規(guī)模細胞破碎的主要手段。細胞破碎器與傳統(tǒng)的機械破碎設(shè)備的操作原理相同，主要基于對物料的擠壓和剪切作用。根據(jù)細胞為彈性體、直徑小、破碎難度大和以回收胞內(nèi)產(chǎn)物為目的、需低溫操作等特點，細胞破碎器采用了特殊的結(jié)構(gòu)設(shè)計。細胞的機械破碎主要有。

高壓勻漿高壓勻漿又稱高壓剪切破碎。高壓勻漿器的破碎原理是：細胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥桿之間的環(huán)隙高速(可達到450m/s)噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。高壓勻漿器的操作壓力通常為50-70MPa。

高壓勻漿法中影響細胞破碎的因素主要有壓力、循環(huán)操作次數(shù)和溫度。細胞破碎率S與操作壓力P和循環(huán)操作次數(shù)N之間的關(guān)系可表達為細胞破碎率用胞內(nèi)產(chǎn)物釋放率表示,是單位質(zhì)量細胞的產(chǎn)物釋放量，mg/cell

高壓勻漿法適用于酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎，料液細胞濃度可達到20％左右。團狀和系狀菌易造成高壓勻漿器堵塞，一般不宜使用高壓勻漿法。高壓勻漿操作的溫度上升約2～3℃／10MPa，為保護目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性，需對料液作冷卻處理，多級破碎操作中需在級間設(shè)置冷卻裝置。因為料液通過勻漿器的時間很短，通過勻漿器后迅速冷卻，可有效防止溫度上升，保護產(chǎn)物活性。

水平攪拌式珠磨機進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃珠、石英砂、氧化鋯等研磨劑(直徑＜1mm﹞一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞受到研磨剪切和撞擊而破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量采用換熱冷卻帶走。珠磨法(Beadmill)珠磨機連續(xù)操作時，兼具破碎和冷卻雙重功能，減少了產(chǎn)物失活的可能性。適合于各種微生物細胞的大規(guī)模破碎操作。

珠磨法的破碎效果，與珠體直徑、裝珠量、細胞濃度、料液性質(zhì)、攪拌器轉(zhuǎn)速與構(gòu)型、操作溫度等參數(shù)有關(guān)。

珠磨機的種類很多，處理規(guī)?？缍群軐挘瑥膶嶒炓?guī)模的組織搗碎機，到工業(yè)規(guī)模的高速珠磨機。如WAB公司的DynoMillKD45C型最大攪拌速度為1450rpm(圓周線速度20m/s)，破碎室體積45L。

珠磨法破碎操作時，產(chǎn)生大量的熱能。但有效能量利用率僅為1％左右。在設(shè)計操作時應(yīng)充分考慮換熱能力問題。珠磨法適用于絕大多數(shù)微生物細胞的破碎，但與高壓均質(zhì)法相比，影響破碎率的操作參數(shù)很多，操作過程的優(yōu)化設(shè)計較復(fù)雜。珠磨法(Beadmilling)破碎細胞可采用間歇或連續(xù)操作。兩種情況下細胞的破碎動力學(xué)均可近似表示

其中k為破碎速率常數(shù)t在間歇操作時為破碎操作時間，連續(xù)操作時為細胞懸浮液在破碎室內(nèi)的平均停留時間

噴霧撞擊法細胞是彈性體，比一般的剛性固體例子難于破碎。將細胞冷凍使其成為剛性球體，降低破碎的難度。噴霧撞擊破碎正是基于這樣的原理。如下圖，細胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)（凍結(jié)速度為每分鐘數(shù)千℃

），形成粒徑小于50微米的微粒子。高速載氣(如N2，流速為300m/s)將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細胞發(fā)生破碎。噴霧撞擊破碎的結(jié)構(gòu)與珠磨法和高壓均質(zhì)法相比，本方法中，細胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的瞬間，細胞破碎程度均勻，可避免細胞反復(fù)受力發(fā)生過度破碎的現(xiàn)象細胞破碎程度可通過無級調(diào)節(jié)載氣壓力（流速）控制，避免細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，適用于細胞器（線粒體、葉綠體等）的回收。噴霧撞擊破碎適用于大多數(shù)微生物細胞和植物細胞的破碎，通常處理細胞懸浮液質(zhì)量濃度為100－200g/L。實驗室規(guī)模的撞擊破碎器間歇處理能力約50－500mL，而工業(yè)規(guī)模的連續(xù)處理能力在10L/h以上。針對目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)（如相對分子質(zhì)量、分子形態(tài)、穩(wěn)定性等），選擇合適的細胞破碎法，并確定適宜的破碎操作條件是非常重要的。如核酸相對分子質(zhì)量很大，破碎中易受剪切損傷。利用高壓均質(zhì)、珠磨、超聲波和噴霧破碎等數(shù)種機械破碎器破碎大腸桿菌，提取質(zhì)粒DNA的研究表明，只有珠磨法的完整質(zhì)粒收率在90％以上，而其他方法的收率低于50％。超聲波破碎

超聲波破碎法(Ultrasonication)利用發(fā)射15—25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。超聲波破碎的機理是：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用(cavitation)，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎。超聲波的細胞破碎效率與細胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。

化學(xué)和生物化學(xué)滲透酸、堿處理化學(xué)試劑處理酶溶酸堿處理

蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，改變pH可改變其荷電性質(zhì)，使蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的相互作用力降低而易于溶解。因此，利用酸堿調(diào)節(jié)pH值，可提高目標(biāo)產(chǎn)物溶解度

?；瘜W(xué)試劑處理

用表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉，TritonX—100等)、螯合劑(如乙二胺四乙酸，簡稱EDTA)、鹽(改變離子強度)或有機溶劑(苯、甲苯等)處理細胞，可增大細胞壁通透性。脲(urea)和鹽酸胍(guanidineHCl)等變性劑(chaotropicagent)能破壞氫鍵作用，降低胞內(nèi)產(chǎn)物之間的相互作用，使之容易釋放。

酶溶

酶溶法(Enzymaticlysis)利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。

溶菌酶(lysozyme)適用于革蘭氏陽性菌細胞壁的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時，需輔以EDTA使之更有效地作用于細胞壁；酵母細胞的酶溶需用Zymolyase(幾種細菌酶的混合物)、β-1,6—葡聚糖酶(β-1，6-dextranase)或甘露糖酶(mannanase)；破壞植物細胞壁需用纖維素酶(cellulase)。

化學(xué)滲透法比機械破碎速度低，效率差，并且化學(xué)或生化試劑的添加形成新的污染，給進一步的分離純化增添麻煩。但是，化學(xué)滲透法比機械破碎的選擇性高，胞內(nèi)產(chǎn)物的總釋放率低，特別是可有效地抑制核酸的釋放，料液粘度小，有利于后處理過程。

物理滲透法

滲透壓沖擊法凍結(jié)—融化法滲透壓沖擊法

滲透壓沖擊(Osmoticshock)是在各種細胞破碎法中最為溫和的一種，適用于易于破碎的細胞，如動物細胞和革蘭氏陰性菌。將細胞置于高滲透壓的介質(zhì)(如較高濃度的甘油或蔗糖溶液)中，達到平衡后，將介質(zhì)突然稀釋或?qū)⒓毎D(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖溶液中。在滲透壓的作用下，水滲透通過細胞壁和膜進入細胞，使細胞壁和膜膨脹破裂。

凍結(jié)—融化法將細胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，此凍結(jié)—融化操作反復(fù)進行多次，使細胞受到破壞。凍結(jié)的作用是破壞細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)，增加其親水性和通透性。另一方面，由于胞內(nèi)水結(jié)晶使胞內(nèi)外產(chǎn)生溶液濃度差，在滲透壓作用下引起細胞膨脹而破裂。凍結(jié)—融化法對于存在于細胞質(zhì)周圍靠近細胞膜的胞內(nèi)產(chǎn)物釋放較為有效。

由于細胞之間以及目標(biāo)產(chǎn)物之間的性質(zhì)差別很大，需通過實驗確定適宜的破碎器和破碎操作條件，獲得最佳的破碎效率。提高破碎率意味著延長破碎操作時間或增加破碎操作次數(shù)，后者往往引起目標(biāo)物的變性或失活。過渡的破碎釋放大量的胞內(nèi)產(chǎn)物，給下游的分離純化操作增加難度。因此，破碎應(yīng)與整個下游加工過程相聯(lián)系，在保證目標(biāo)產(chǎn)物有較高收率的前提下，使下游加工過程的成本降低。選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的一般原則：(1)僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置周圍當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細胞膜附近時，可采用較溫和的方法，如酶溶法(包括自溶法)、滲透壓沖擊法和凍結(jié)－融化法等。當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細胞質(zhì)內(nèi)時，則需采用強烈的機械破碎法。選擇性釋放胞內(nèi)產(chǎn)物流程(2)選擇性溶解目標(biāo)產(chǎn)物當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物處于與細胞膜或細胞壁結(jié)合的狀態(tài)時，調(diào)整溶液pH值、離子強度或添加與目標(biāo)產(chǎn)物有親和性的試劑如螯合劑、表面活性劑等，使目標(biāo)產(chǎn)物容易溶解釋放。同時，溶液性質(zhì)應(yīng)使其他雜質(zhì)不易溶出。