犐犆犛６５．０２０．３０

犅４４

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

犌犅／犜１８４４８．２—２００８

代替ＧＢ／Ｔ１８４４８．２—２００１

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲(chóng)檢測(cè)方法

犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犪狀犻犿犪犾—犕犲狋犺狅犱犳狅狉犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犜狅狓狅狆犾犪狊犿犪犵狅狀犱犻犻

２００８１２０３發(fā)布２００９０３０１實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局

發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

書(shū)

犌犅／犜１８４４８．２—２００８

前言

ＧＢ／Ｔ１８４４８《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物》由１０項(xiàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物寄生蟲(chóng)檢測(cè)方法組成。

本部分為ＧＢ／Ｔ１８４４８的第２部分《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲(chóng)檢測(cè)方法》。

本部分自實(shí)施之日起代替ＧＢ／Ｔ１８４４８．２—２００１。

本部分與ＧＢ／Ｔ１８４４８．２—２００１相比主要技術(shù)差異如下：

ａ）增加弓形蟲(chóng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ＥＬＩＳＡ）和免疫酶染色試驗(yàn)（ＩＥＡ），將ＰＣＲ檢測(cè)方法列入附錄

內(nèi)容，保留間接血凝試驗(yàn)（ＩＨＡ）作為推薦方法之一；

ｂ）將檢測(cè)方法所需的“材料與試劑”和“檢測(cè)步驟”分別敘述。

本部分附錄Ａ是規(guī)范性附錄。

本部分由全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口。

本部分起草單位：全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)。

本部分主要起草人：潘振業(yè)、屈霞琴、陳俏梅、李冠民、王彥平。

本部分所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：

———ＧＢ／Ｔ１４９２６．３４—１９９４，ＧＢ／Ｔ１８４４８．２—２００１。

Ⅰ

書(shū)

犌犅／犜１８４４８．２—２００８

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲(chóng)檢測(cè)方法

１范圍

ＧＢ／Ｔ１８４４８的本部分規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲(chóng)的檢測(cè)方法和試劑等。

本部分適用于小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬及猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲(chóng)的檢測(cè)。

２原理

根據(jù)免疫學(xué)原理，采用弓形蟲(chóng)抗原檢測(cè)被檢動(dòng)物血清中的弓形蟲(chóng)抗體。

３主要試劑和器材

３．１試劑

３．１．１ＥＬＩＳＡ抗原

３．１．１．１特異性抗原

弓形蟲(chóng)（ＲＨ株）速殖子腹腔接種清潔級(jí)以上實(shí)驗(yàn)小鼠（ＫＭ、ＩＣＲ、ＢＡＬＢ／ｃ等均可），３ｄ～５ｄ后，以

無(wú)菌生理鹽水灌洗被接種小鼠的腹腔，收集含有蟲(chóng)體的小鼠腹腔液，３０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取沉淀，

ＰＢＳ洗３次。沉淀物加適量蒸餾水反復(fù)凍融５次，或用超聲波處理后，１００００ｒ／ｍｉｎ離心３０ｍｉｎ，取上

清液。上清液用葡聚糖凝膠Ｇ２００進(jìn)行純化（柱內(nèi)徑×柱高：１．５ｃｍ×６０ｃｍ），流速為０．２ｍＬ／ｍｉｎ。每

管收集２ｍＬ左右。共收集６０管以上。分別測(cè)定每個(gè)收集管中蛋白在２８０ｎｍ下的吸光度值。分離純

化后，出現(xiàn)２個(gè)蛋白峰；將第一峰各管合并，即為弓形蟲(chóng)特異性抗原（也稱(chēng)弓形蟲(chóng)可溶性抗原）。

３．１．１．２正?？乖?/p>

以無(wú)菌生理鹽水注射清潔級(jí)以上實(shí)驗(yàn)小鼠（與制備抗原的小鼠同品種或品系）腹腔，３ｄ～５ｄ后，以

無(wú)菌生理鹽水灌洗被注射小鼠腹腔，收集小鼠腹腔液，３０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取沉淀，ＰＢＳ洗３次。

沉淀物加適量蒸餾水反復(fù)凍融５次，或用超聲波處理后，１００００ｒ／ｍｉｎ離心３０ｍｉｎ，取上清液，即為正常

抗原。

３．１．２抗原片

弓形蟲(chóng)ＲＨ株速殖子腹腔接種清潔級(jí)以上實(shí)驗(yàn)小鼠（ＫＭ、ＩＣＲ、ＢＡＬＢ／ｃ等均可），３ｄ～５ｄ后處

死，收取蟲(chóng)體，胰酶消化，以一定濃度涂片，充分晾干后冷丙酮固定，－２０℃保存。

３．１．３弓形蟲(chóng)抗原致敏綿羊紅細(xì)胞

將綿羊紅細(xì)胞與一定濃度的鞣酸液反應(yīng)，制成鞣化紅細(xì)胞，然后，用弓形蟲(chóng)可溶性抗原在適宜的條

件下致敏鞣化紅細(xì)胞，制成弓形蟲(chóng)抗原致敏綿羊紅細(xì)胞。

３．１．４正常對(duì)照綿羊紅細(xì)胞。

３．１．５陽(yáng)性對(duì)照血清

自然感染弓形蟲(chóng)的相應(yīng)動(dòng)物抗體陽(yáng)性血清，或弓形蟲(chóng)免疫血清。

３．１．６陰性對(duì)照血清

確證無(wú)弓形蟲(chóng)感染的動(dòng)物血清。

３．１．７酶結(jié)合物

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬和猴ＩｇＧ