植物基因工程Bt抗蟲(chóng)基因載體構(gòu)建

一、流程二、Bt基因簡(jiǎn)介三、Bt基因的合成四、Ti質(zhì)粒簡(jiǎn)介五、Ti質(zhì)粒改造（酶切、連接和檢驗(yàn)）一、Bt抗蟲(chóng)基因載體構(gòu)建流程

NCBI查詢(xún)獲取Bt基因序列

以Bt基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物Bt抗蟲(chóng)基因的合成PCR、切膠回收

DH5α、PMD—18克隆

LB、Amp篩選

Bt基因

酶切連接檢驗(yàn)

Ti質(zhì)粒二、Bt基因簡(jiǎn)介Bt基因即是蘇云金芽胞桿菌基因。蘇云金芽胞桿菌在外界條件苛刻或營(yíng)養(yǎng)體老熟時(shí)，將進(jìn)入產(chǎn)胞循環(huán)，包裹在芽胞與晶體外側(cè)的細(xì)菌壁在后期破裂，釋放出自由的芽胞和伴胞晶體；伴胞晶體對(duì)鱗翅目和鞘翅目昆蟲(chóng)（比如小菜蛾）有很強(qiáng)的殺傷作用。三、Bt基因的合成通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得Bt基因序列，并以此為模板設(shè)計(jì)引物。引物的設(shè)計(jì)通過(guò)軟件primer5來(lái)完成。引物設(shè)計(jì)的一般原則

序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段。避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。

Tm值在55－65℃（因?yàn)?0℃核酸外切酶活性最高）四、Ti質(zhì)粒簡(jiǎn)介五、Ti質(zhì)粒改造酶切連接檢驗(yàn)5.1酶切野生型的Ti質(zhì)粒作載體時(shí)，影響植株再生的直接原因是T-DNA中Onc基因的致瘤作用。因此，為了使野生型的Ti質(zhì)粒成為基因轉(zhuǎn)化的載體，必須切除T-DNA上的Onc基因。5.1酶切切除T—DNA上的致瘤基因，僅保留兩側(cè)邊界與T-DNA準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移所需的25個(gè)堿基序列。已經(jīng)缺失的T-DNA部位被大腸桿菌的一種常用的質(zhì)粒pBR322取代。這樣任何適合于克隆在pBR322質(zhì)粒中的外源DNA片段，都可以通過(guò)pBR322質(zhì)粒DNA的同源重組，而被共整合到Onc-Ti質(zhì)粒載體上。5.2酶切位點(diǎn)的處理用相同的限制內(nèi)切酶切割Bt基因所在片段和Ti質(zhì)粒，使目的基因和Ti質(zhì)粒產(chǎn)生的缺口能夠互補(bǔ)而獲得酶切序列。設(shè)計(jì)目的基因引物時(shí)酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。5.3鏈接

在連接酶作用下目的基因與大腸桿菌質(zhì)粒進(jìn)行連接

培養(yǎng)連接后將TI質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，并在LB+Amp培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。選擇出轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌繼續(xù)培養(yǎng)。5.4檢驗(yàn)

一、酶切檢驗(yàn)：用上一步中所用的限制內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，切割下來(lái)的片段測(cè)序，看是否是目的基因。二、PCR檢驗(yàn)：通過(guò)PCR擴(kuò)增出大量序列，與Marker比較鑒別是否是目的基因。目的基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中大腸