植物基因工程Bt抗蟲基因載體構建

一、流程二、Bt基因簡介三、Bt基因的合成四、Ti質粒簡介五、Ti質粒改造（酶切、連接和檢驗）一、Bt抗蟲基因載體構建流程

NCBI查詢獲取Bt基因序列

以Bt基因為模板設計引物Bt抗蟲基因的合成PCR、切膠回收

DH5α、PMD—18克隆

LB、Amp篩選

Bt基因

酶切連接檢驗

Ti質粒二、Bt基因簡介Bt基因即是蘇云金芽胞桿菌基因。蘇云金芽胞桿菌在外界條件苛刻或營養(yǎng)體老熟時，將進入產(chǎn)胞循環(huán)，包裹在芽胞與晶體外側的細菌壁在后期破裂，釋放出自由的芽胞和伴胞晶體；伴胞晶體對鱗翅目和鞘翅目昆蟲（比如小菜蛾）有很強的殺傷作用。三、Bt基因的合成通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得Bt基因序列，并以此為模板設計引物。引物的設計通過軟件primer5來完成。引物設計的一般原則

序列選取應在基因的保守區(qū)段。避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結構。引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。

Tm值在55－65℃（因為60℃核酸外切酶活性最高）四、Ti質粒簡介五、Ti質粒改造酶切連接檢驗5.1酶切野生型的Ti質粒作載體時，影響植株再生的直接原因是T-DNA中Onc基因的致瘤作用。因此，為了使野生型的Ti質粒成為基因轉化的載體，必須切除T-DNA上的Onc基因。5.1酶切切除T—DNA上的致瘤基因，僅保留兩側邊界與T-DNA準確轉移所需的25個堿基序列。已經(jīng)缺失的T-DNA部位被大腸桿菌的一種常用的質粒pBR322取代。這樣任何適合于克隆在pBR322質粒中的外源DNA片段，都可以通過pBR322質粒DNA的同源重組，而被共整合到Onc-Ti質粒載體上。5.2酶切位點的處理用相同的限制內切酶切割Bt基因所在片段和Ti質粒，使目的基因和Ti質粒產(chǎn)生的缺口能夠互補而獲得酶切序列。設計目的基因引物時酶切位點及保護堿基。5.3鏈接

在連接酶作用下目的基因與大腸桿菌質粒進行連接

培養(yǎng)連接后將TI質粒轉入大腸桿菌中，并在LB+Amp培養(yǎng)基內培養(yǎng)。選擇出轉化成功的農(nóng)桿菌繼續(xù)培養(yǎng)。5.4檢驗

一、酶切檢驗：用上一步中所用的限制內切酶切割質粒，切割下來的片段測序，看是否是目的基因。二、PCR檢驗：通過PCR擴增出大量序列，與Marker比較鑒別是否是目的基因。目的基因轉入農(nóng)桿菌中大腸