基礎醫(yī)學第三講分子生物學在藥理學中的應用單細胞凝膠電泳法（SCGE)

熒光原位雜交技術（FISH）

單鏈構象多態(tài)性分析（PCR-SSCP)

mRNA差異顯示技術（DDRT-PCR)

抑制消減雜交技術（SSH）

基因芯片技術

轉基因動物一、單細胞凝膠電泳法(SCGE)單細胞凝膠電泳（Single-CellGelElectrophoresis,SCGE）：又稱慧星試驗（cometassay），是一項較新的電泳方法。自1978年被Rydcbert等人成功地用于檢驗單細胞DNA單鏈斷裂以來，經(jīng)過不斷的改進，已成為一種快速、靈敏、簡便的檢測DNA損傷的方法，廣泛地應用于DNA放射損傷、藥物的遺傳毒性評價、細胞凋亡鑒定等工作中。1.SCGE的基本原理有核細胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋結構附著在核基質(zhì)中，用瓊脂糖凝膠將細胞包埋在載玻片上，在細胞裂解液作用下，細胞膜、核膜及其它生物膜遭到破壞，使細胞內(nèi)的RNA、蛋白質(zhì)及其它成分進入凝膠，繼而擴散到裂解液中，但核DNA仍保持纏繞狀態(tài)附著在剩余的核骨架上，并留在原位。DNA超螺旋結構細胞未受損傷:

電泳時，核DNA停留在核基質(zhì)中，呈圓形熒光團，無拖尾現(xiàn)象。細胞受損:在中性電泳液（PH=8）中，DNA雙鏈斷裂時，斷片進入凝膠，電泳時向陽極遷移，形成熒光拖尾現(xiàn)象，形似彗星。在堿性電泳液（PH＞13）中，堿變性為單鏈，單鏈碎片進入凝膠，電泳時離開核DNA向陽極遷移，形成拖尾。Singh等人1988年描述的SCGE具體操作方法(堿性SCGE法)

：細胞樣品處理：細胞染毒和細胞制備①細胞染毒：invitro,可直接將受試物加到生長培養(yǎng)基中，也可對包埋于瓊脂糖中細胞進行染毒；invivo，以不同途徑給動物染毒，間隔一定時間后，取組織分離細胞，檢測細胞活力，立即進行SCGE分析。2.SCGE的簡要操作步驟②細胞制備：單細胞培養(yǎng)時要注意胰酶消化和刮取收獲細胞的方式可誘導DNA損傷。制片：首先制備細胞懸液，然后制片。常用“三明治”凝膠：第一層，5％正常熔點瓊脂糖，第二層，細胞懸液與0.5％低熔點瓊脂糖混合液（10：1）,第三層，0.5％低熔點瓊脂糖。細胞裂解：堿性試驗中，pH值為10～12的含去污劑的高鹽溶液做溶解液，以裂解細胞。電泳：電泳前先將玻片浸沒于堿性電泳緩沖液中，使DNA解螺旋，然后進行電泳。中和，染色：用Tris緩沖液中和凝膠后，用染色劑染色。常用染色劑有溴化乙錠、吖啶橙、碘化丙啶（PI）等。圖像分析：在熒光顯微鏡下觀察單細胞電泳圖像3.SCGE的主要計算指標

典型的DNA損傷細胞熒光圖像象慧星一樣頭尾分明。（1）形狀指標比較粗略的指標。細胞分類：慧星樣細胞和非慧星樣細胞；計數(shù)一定量細胞中慧星樣細胞所占的比例，即慧星樣細胞發(fā)生率，估計DNA的損傷程度。特點：可通過鏡下觀察直接得到，方便實用。（2）距離指標

尾長，即沿電泳方向“慧星”尾部最遠端與頭部中心的距離；總慧星長度，即“慧星”電泳方向上的最大長度；尾長與頭部直徑比值等，以評價DNA損傷程度。特點：泳動距離易于測量，無需復雜的儀器設備及圖像處理軟件，在損傷因素劑量較大時，這些數(shù)值的大小與作用劑量之間呈較為良好的線性關系。（3）強度指標用“慧星”頭部中心處熒光強度與電泳方向上一定距離處熒光強度的比值來描述DNA的損傷；根據(jù)“慧星”尾部熒光強度將細胞分為五類，由弱到強分別計為0、1、2、3、4，將100個細胞的分值加在一起表示DNA的損傷程度，該數(shù)值與總慧星長度有較好的相關性。特點：不同程度地反映了電泳中泳動DNA的量。（4）“矩”類指標

“尾矩”（tailmoment，TM），尾部DNA占總DNA的百分比與頭、尾部中心間距的乘積。特點：優(yōu)越，被廣泛接受。優(yōu)點：反映細胞群體中不同類型細胞對作用因素的不同反應，為確定遺傳毒性因素的靶細胞提供可能；方便易行，對細胞所處生長狀態(tài)沒有要求，也不需同位素標記，適用于各種有核細胞；樣品用量少；試驗周期短，靈敏、快速；對各種理化因素都較敏感，費用少，非常適用于接觸遺傳性有害因素人群的生物檢測，并可用于篩檢對DNA損傷因素敏感的高危人群。4.SCGE方法的優(yōu)缺點不足：各實驗室的操作方法差異極大，包括溶解液、電泳液的配方，電泳參數(shù)、DNA結合熒光染料的選擇都沒有標準化。評價標準不統(tǒng)一，有待改進和完善5.SCGE在藥理學與毒理學中的應用(1)DNA損傷與修復的研究很多化學物質(zhì)對DNA具有損傷作用，如氯乙烯(VCM)，交聯(lián)劑（如絲裂霉素C，MMC）、氧化劑等。(2)遺傳毒性評價(SCGE可能是研究低劑量遺傳效應最有效的工具)如：二氯胺基酚≧50μg/ml，V79細胞出現(xiàn)明顯的DNA遷移，證明二氯胺基酚是DNA損傷劑。(3)生物檢測

放射檢測：以人外周血淋巴細胞作為檢測材料，γ射線照射－誘導突變；

環(huán)境因素對健康影響的早期檢測：長期接觸苯的工人，其淋巴細胞DNA損傷比對照組顯著提高；

吸煙者比不吸煙者患肺癌的幾率高7－11倍；被動吸煙者患癌癥的比例也在增加。

(4)細胞凋亡的研究

凋亡細胞DNA斷裂很有規(guī)律，發(fā)生在核小體之間，產(chǎn)生180～200bp大小的DNA片段，在SCGE試驗中呈現(xiàn)形態(tài)學特征。

？小頭大尾

熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是20世紀80年代末期在原有放射性原位雜交技術（insituhybridization,ISH）的基礎上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術。二、熒光原位雜交技術(FISH)1.FISH技術基本原理通過熒光標記的已知各類DNA和RNA單鏈核酸探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料（組織、細胞或染色體）中未知的單鏈核酸（DNA、RNA）在載玻片上進行特異性結合（雜交），形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。2.探針分類與標記

按結合位點分類：染色體特異性序列探針、由許多DNA大片段組成的全染色體探針和著絲點探針按制備方法分類：直標型探針和間標型探針直標型探針：DNA探針直接共價連接熒光素基團；低背景、高特異性間標型探針：DNA探針先與某個半抗原（生物素或地高辛）連，再與熒光素基團連接形成探針－半抗原－熒光素基團。靈敏度高3.FISH簡要操作步驟（1）探針的制備和標記（2）原位雜交：變性處理染色體標本和探針，復性雜交（3）熒光檢測：直標型探針，熒光標記的卵白素；間標型探針，熒光標記的相應抗體。常用熒光標記分子有異硫氰熒光素（綠光）、羅丹明（紅光）、德州紅（深紅）等。（4）熒光顯微鏡檢測：特定波長光波激發(fā)4.FISH特點(1)避免使用放射性同位素帶來的問題;(2)熒光試劑和探針標記相對經(jīng)濟和安全；(3)快速、檢測信號強、雜交特性高；(4)可同時分析中期和間期核，靈敏度高；(5)定位的DNA序列從1kb發(fā)展到整條染色體范圍；(6)根據(jù)基因組部位不同用不同顏色標記探針，可在同一細胞核或中期染色體中顯示不同的顏色，可同時觀察代表不同染色體區(qū)域的熒光信號多色FISHM-FISH技術熒光原位雜交不同熒光物質(zhì)標記的探針顯示同一細胞

不同染色體區(qū)段上的DNA

5.FISH在藥理學與毒理學研究中的應用（1）檢測有絲分裂中期細胞染色體畸變（2）檢測間期細胞染色體畸變常用間期分析方法是用特異染色體區(qū)域探針，如著絲重復序列探針進行雜交，檢測染色體非整倍體異常。5.FISH在藥理學與毒理學研究中的應用（3）哺乳動物精子非整倍體檢測是有效檢測人精子遺傳損傷尤其是染色體數(shù)目異常的可靠手段。如：用FISH技術評價吸煙、飲酒以及飲用咖啡等對精子染色體非整倍體的影響。（4）微核來源鑒定三、PCR-SSCP技術單鏈構象多態(tài)性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP):指單鏈DNA由于有鏈內(nèi)堿基配對而具有一定的空間構象，當DNA鏈上的堿基發(fā)生改變時，單鏈DNA會形成不同的構象。

1.基本原理

將DNA單鏈放入非變性溶液，它將以序列特異方式折疊，形成具有一定空間結構的構象。而如果一個堿基發(fā)生改變，該分子折疊的形狀和大小就會有所不同。用非變性凝脈電泳分離時，不同形狀的DNA分子可能以不同的速度移動，電泳完畢，這些片段位置就會不同，借此可以顯示片段中是否有堿基改變。2.簡要操作步驟以檢測P53基因突變?yōu)槔海?）PCR擴增目的片段DNA；（2）將樣品的1/10（約5μl）稀釋于15-40μl0.1%SDS，10mMEDTA溶液；（3）按1:1將上述溶液與98%甲酰胺、89mMTris、2mMEDTA、89mM甲酸、0.05%溴酚蘭、0.05%二甲苯青上樣液混合；（4）95℃熱變性2分鐘（產(chǎn)生單鏈，變性應徹底）；（5）上樣（a）6%非變性聚丙烯酰胺凝膠，（b）6%非變性聚丙烯酰胺凝膠加10%甘油；（6）在室溫電泳，8W8-16小時；（7）放射自顯影或銀染法3.影響SSCP分析結果的因素（1）片段大小最重要的因素Sheffield等人（1993年）對3個基因64個突變的研究結果復合而成的。最佳片段大小為155bp。（2）凝膠的孔徑/交聯(lián)度：10％凝膠，1.3％交聯(lián)度較好

（3）堿基組成和凝膠中甘油濃度（高G+C含量，蔗糖比甘油好）（4）電泳條件：溫度和電泳緩沖液的離子強度等

條件優(yōu)化：室溫5-10%甘油或4℃無甘油的情況下進行電泳會獲得比較好的分析結果

（5）突變和鄰近序列效應（corctexteffects）突變所在片段的性質(zhì)及突變所處的位置對檢測有影響4.SSCP方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：簡便，步驟少，無復雜的理論，無需特殊設備，突變條帶與野生型分開后可用于分析，可以不用放射標記進行測定，即銀染法；缺點：

突變位置未知，分析片段的大小受限制（150～200bp），強烈依賴實驗條件的選擇，可能會漏檢突變，有時電泳結果比較復雜難于解釋。5.在藥理學和毒理學中的應用（1）癌基因和抗癌基因突變的鑒定趙永良等大鼠氣管上皮細胞p53基因突變，轉化細胞中p53基因Exon8的單鏈條帶有差異，經(jīng)證實G265C，精氨酸脯氨酸。α粒子輻射（2）化學致癌劑的致癌機理研究Maino等在1992年用化學致癌劑誘發(fā)小鼠鱗狀細胞癌，用SSCP法檢測出了特異性H-ras基因的第13密碼子發(fā)生了突變。（3）P450酶基因的突變研究

人CYP4F12基因組8個突變四、mRNA差異顯示技術（DDRT-PCR）

高等生物,30000個基因，10%的基因表達，按時間和空間順序有序進行。包括新出現(xiàn)的基因表達與表達量有差異的基因表達。生物體表現(xiàn)出的各種特性，由基因的差異表達引起。藥物/毒物和環(huán)境因素引起的基因改變和新基因的出現(xiàn),未知；未知新基因的發(fā)現(xiàn)、分離和克隆是一項非常重要和具有創(chuàng)造性的工作。

常見差異性表達mRNA方法：

（1）mRNA差異顯示（mRNA-DifferentialDisplay，mRNA-DD）（2）抑制性消減雜交（SuppressionSubtractiveHybridization，SSH）（3）cDNA代表性差異分析（cDNARepresentationalDifferenceAnalysis，cDNA-RDA）（4）cDNAmicroarray

原理：

真核細胞mRNA3’端具有多聚腺苷酸尾（polyA）結構，用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA。設計合成12種下游引物，即3′-錨定引物，通式為5’-TnMN-3′(n=10~20,M=dA/dC/dGN=dA/dC/dG/dT)。

5’-端隨機引物：20種，10bp

創(chuàng)始人LiangP和PardeeA

（一）傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術（DDRT-PCR）DDRT-PCR的優(yōu)缺點：優(yōu)點:（1）速度快,較易操作；（2)由于PCR擴增技術的應用,使得低豐度mRNA的鑒定成為可能,且靈敏度高；（3)可同時比較兩種以上不同來源的mRNA樣品間基因表達的差異。

缺點:

（1）出現(xiàn)差別條帶太多,假陽性率高達70%左右,重復性差,且對高拷貝數(shù)的mRNA具很強的傾向性；（2）在有差異的顯示片段中難以知道哪個基因是已經(jīng)研究過的，哪些是未知基因；（3）得到的有差異的擴增條帶短,一般在110～450bp之間；（4）局限性，只適合含PolyA尾的真核生物。

原理：

首先以oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA。

再用限制性內(nèi)切酶酶切cDNA，然后在酶切后的cDNA片段兩邊加上特殊接頭進行擴增。

（二）改進的限制性酶切片段差異顯示技術（RFDD-PCR）參考文獻：胡岳山;李杰芬;王劍.限制性酶切片段差異顯示及其應用.生物技術通訊.2004,15(1):65-66改進的限制性酶切片段差異顯示技術（RFDD-PCR）RFDD-PCR優(yōu)點（1）采用優(yōu)先切割翻譯序列的限制性內(nèi)切酶（如TaqI），優(yōu)先展示編碼區(qū)，更加適合于下游功能分析；（2）使用標記引物來擴增，使差異條帶檢測更便利、靈敏；（3）重復性更高，極大地降低了假陽性率。原理：

基于抑制PCR,并結合標準化(normalization或equalization)和消減雜交(substractivehybridization)。抑制PCR通過利用含引物序列的雙鏈接頭(adaptor)充當引物模板,使兩端接上同一接頭的非目的雙鏈片段具有反向末端重復序列,PCR中不能擴增,從而達到抑制非目的片段而選擇性擴增目的片段的目的。標準化步驟平衡了目的基因群(tester)中cDNA的豐度,即低豐度差異表達的基因不會丟失,而高豐度差異表達的基因又不會被過量分離。消減雜交則扣除了目的基因群(tester)與驅(qū)趕基因群(driver)間的同源序列。

由Diatchenko等于1996年以mRNA差異顯示技術為基礎建立起來的篩選未知差異表達基因的新技術。

（三）抑制消減雜交技術（SSH）suppressionsubtractivehybridization（SSH）SSH的優(yōu)缺點優(yōu)點:（1）在雜交過程中，高豐度的雜交雙方較低豐度者容易退火，因而經(jīng)第一次消減雜交后，未雜交的高、低中度豐度序列濃度趨向一致；（2)操作容易掌握，步驟簡便。無需像DDRT-PCR那樣，對每一條片段單獨進行克隆；（3)敏感性較高；（4)重復性和可靠性高，真陽性率可達90%以上。缺點:（1）所需mRNA樣品量較多（1~2μg）（2)同DDRT-PCR和RDA等方法一樣，SSH中產(chǎn)生的cDNA片段以基因3’端序列為多。

（3)一次只能比較兩個樣本（1）腫瘤相關基因的篩選；（2）外源化合物或環(huán)境因素誘導的特異基因的研究；周等將人肺A549細胞暴露于鎳化合物，Ni3S2與NiCl2均可誘導出Cap43基因，另外的12種金屬化合物未能誘導出。結論：Cap43是鎳化合物誘導的特異基因。（3）細胞凋亡基因表達的差異分析；（4）藥物/毒物作用機理研究和細菌耐藥機理研究。差異顯示技術在藥理學和毒理學中的應用如：差異表達基因篩選－大腸桿菌對喹噁啉類耐藥分子機制研究檢測對象（tester）：大腸桿菌79O4-2驅(qū)趕者（driver）：大腸桿菌79~20

篩選到44個差異片段，其中18個為物質(zhì)合成相關基因，11個為物質(zhì)代謝相關基因，3個為膜轉運蛋白基因，3個為參與鞭毛裝配的蛋白基因，1個為質(zhì)粒上的遷移蛋白基因，5個為功能未知的假定蛋白基因，3個在Genbank中未找到顯著相似序列。18個物質(zhì)合成相關基因分別參與蛋白質(zhì)、硫辛酸、類脂A、腸道菌共同抗原、脂肪酸、海藻糖和CTP的生物合成，11個物質(zhì)代謝相關基因分別參與損傷蛋白及時清除、糖原分解、氧化磷酸化過程。差異片段同源性分析推測耐藥機理：通過啟動鐵硫簇結合蛋白、硫辛酸合成蛋白（LipA）和海藻糖合成蛋白（OtsA）的表達，抵抗氧化損傷

五、基因芯片技術

基因芯片(Genechip)：又稱DNA芯片（DNAChip）或生物芯片(Biologicalchip）?；蛐酒夹g是隨著人類基因組計劃的進展而發(fā)展起來的，是90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一。融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的新技術。

1.基本原理：采用原位合成（insitusynthesis）或顯微打印手段，將數(shù)以萬計的DNA探針固化于支持物（substrate）表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標記的樣品按堿基配對的原理進行雜交，通過檢測雜交信號來實現(xiàn)對生物樣品快速、高通量、高效的檢測或醫(yī)學診斷。

2.基因芯片的主要類型：

以片基(substrate)的不同分類：可以分為無機片基和有機合成物片基。片基探針固定方式探針密度顯色及檢測方式無機片基如玻片、半導體硅片等原位合成（insitusynthesis）高熒光，激光共聚焦掃描、定量分析；生物傳感器等有機合成片基如NC、Nylon膜等離片合成后點樣(off-chipsynthesis)低熒光基因芯片的主要類型及其簡要特點以探針不同分類：主要有基因芯片（DNA和cDNA），蛋白質(zhì)或肽芯片、組織芯片等。3.

技術路線以核酸雜交為原理的檢測技術，其主要過程為：

樣品制備：擴增的靶序列或樣品標記雜交：標記靶序列或樣品與探針雜交

芯片清洗

圖象的分析:

激光共聚焦顯微鏡對芯片掃描并進行分析。

GeneExpressionMicroarry技術路線

4.優(yōu)缺點：（1）高通量：一次可以對大量的DNA分子或RNA分子進行檢測分析；（2）自動化程度高；（3）高效率；（4）需專用的儀器設備；（5）需專用的程序軟件分析，成本高（6）要求全基因組序列已知（1）大規(guī)模篩選差異表達基因以及環(huán)境有害因素對基因表達的影響研究

mRNA差異顯示、cDNA代表性差異分析、SSH：只能對少數(shù)基因的表達進行分析；針對性不強，效率低下，絕大部分工作都是繁瑣重復勞動。5.基因芯片技術在藥理學和毒理學中的應用基因芯片技術：能夠從整個基因組水平上對某一刺激或疾病進行檢測。通過基因芯片分析正常組織和藥物處理組織基因表達情況的差異，能夠從表達異常的基因中發(fā)現(xiàn)新的藥物作用相關基因（靶點）。Brown等就正常人與病人的T細胞標本對表達的變異與數(shù)千個遺傳、遺傳流行病和環(huán)境條件的圖像進行比較，以確定與二氧化物和汞接觸的關系。（2）用于基因突變的檢測及基因組多態(tài)性的分析對人BRCAⅠ基因外顯子11、CFTR基因、β-地中海貧血、酵母突變菌株間、HIV-1逆轉錄酶及蛋白酶基因等的突變檢測、耐藥突變點的檢測等；對人類基因組單核苷酸多態(tài)性的鑒定、作圖和分型，人線粒體16.6kb基因組多態(tài)性的研究等。

（3）研制的毒理芯片的應用原理：根據(jù)cDNA微陣列可以測定基因表達，反過來特定的基因表達就可以作為被測試樣品毒性信息的標記物。通過構建大量模型化合物的毒理效應數(shù)據(jù)庫，分析大量某類化學物質(zhì)，揭示出遭受特定暴露時開放或關閉的基因模式。一類毒性終點的基因表達變化具有其共性的“標記”，一旦建立起毒物標記庫，可以在同一模型系統(tǒng)下將未知藥物所引起的基因表達與庫中的數(shù)據(jù)相對比，通過這種對比匹配，能獲得未知藥物的毒理作用機制。（3）研制的毒理芯片的應用不同機制的化合物都有其特定的基因指紋圖譜，如果得到所有藥物的基因指紋，就得到了輪廓或識別模式，有了這一模式，當對一個新藥物進行測試時，通過微陣列芯片測定得到基因表現(xiàn)性輪廓，就能預測出該藥物的毒理性質(zhì)。

應用：研究受檢毒物的毒作用機制；確定以基因表達模式為基礎的化合物的毒性毒理芯片的局限性毒理芯片僅能用于檢測在mRNA水平上基因的變化，不能檢測由該基因翻譯的功能蛋白質(zhì)所發(fā)生的變化；許多藥物是通過與蛋白質(zhì)的結合或改變大分子的結構來表現(xiàn)最初毒性的，而并不是直接誘導基因表達或使基因表達發(fā)生改變；對于多機制作用藥物的分析，利用基因表達圖譜則很難描繪出藥物最初的毒性作用；雖然在單一因素下能夠根據(jù)數(shù)據(jù)庫和基因表達圖譜預測出藥物毒性，但如果實驗條件不同則不能肯定其預測性。（4）其它應用藥物靶標篩選藥物抗性的鑒定環(huán)境毒理學檢測生態(tài)毒理學檢測六、轉基因動物1.定義

轉基因動物（transgenicanimal）：是指在體內(nèi)基因組中穩(wěn)定地整合有外源基因的遺傳工程動物，其外源基因可遺傳給后代。轉基因動物集整體、細胞和分子水平于一體，更能體現(xiàn)生命整體研究的效果。2.轉基因動物發(fā)展簡史：

1974年,Jaenisch等將病毒SV40的DNA注入小鼠的胚泡，首次成功地培育轉基因動物。

1982年，Palmiter等用顯微注射法成功地得到了7只轉基因小鼠。

此后，轉基因動物技術迅速發(fā)展，被廣泛應用于生物醫(yī)學研究的各個方面。

3.

轉基因動物模型的構建（1）目的基因的構建首先要構建欲研究的目的基因，即“轉基因”（transgene）。標準的轉基因包括：編碼序列和使之有效表達的調(diào)控元件，如promoter、轉錄起始位點、5’UTR、startcode、codingregion、stopcodeand3’UTR等。（2）目的基因的導入導入基因的不同方式：原核顯微注射法逆轉錄病毒感染法胚胎干細胞植入法

①

原核顯微注射法：主要步驟：準備假孕動物；收集受精卵；用顯微注射的方法將外源基因直接注入受精卵的雄性原核內(nèi)；將注入目的基因的受精卵植入假孕動物的輸卵管內(nèi)，使其生長發(fā)育。對幼鼠進行鑒定

對幼鼠的鑒定：幼鼠斷乳后自尾部提取DNA，與目的基因探針作分子雜交，鑒定外源基因是否整合。建立鼠系，將帶有外源基因的小鼠與未經(jīng)轉基因的小鼠交配、傳代后，后代有50％概率帶有整合的基因供實驗用。自小鼠內(nèi)臟提取RNA，與目的基因探針做分子雜交，以鑒定外源基因的表達和表達的組織特異性。表達產(chǎn)物可以測定活性的，也可直接自血液或組織測定活性蛋白質(zhì)，常用的方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)或放射免疫測定(RIA)等。原核顯微注射法優(yōu)點：任何DNA序列（大至50kb）均可直接導入原核；整合效率高（約25％的新生小鼠攜帶外源基因）；大部分轉基因小鼠的所有細胞包括生殖細胞都帶有外源基因；操作過程比較省時省力

缺點：對操作人員技術要求較高；受整合位點的影響：外源基因隨機整合到宿主染色體的某一位點上，可能破壞內(nèi)源基因序列或激活致癌基因，造成動物發(fā)育障礙或死亡。②逆轉錄病毒感染法：應用重組技術將目的基因、病毒長末端重復序列（LTR）和包裝序列整合在一起，形成完整的病毒顆粒，再用這樣的病毒去感染受體細胞就可以實現(xiàn)基因轉移的目的。

優(yōu)點：方法簡單、不受胚胎發(fā)育階段的影響、轉移效率高，幾乎可達到100％；

缺點：易激活宿主癌細胞，外源基因片段的長度受限制，一般不能超過10kb。③胚胎干細胞植入法：胚胎干細胞：人或動物的胚胎中存在的一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的細胞。胚胎干細胞特點：體外可以分化形成肝細胞、心肌細胞、造血干細胞和神經(jīng)纖維細胞等各種體細胞；可以從早期胚胎胚泡的內(nèi)細胞團或桑椹胚的原始生殖細胞中分離獲得；體外培養(yǎng)壽命比胎兒細胞和成體細胞要長。胚胎干細胞是克隆哺乳動物供核細胞最佳來源胚胎干細胞植入法步驟：選擇合適的載體，將目的基因與其重組，構建重組質(zhì)粒。(2)重組質(zhì)粒線性化后，用電穿孔、脂質(zhì)體等方法將其轉入體外培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞中。(3)體外篩選穩(wěn)定整合外源基因的胚胎干細胞。(4)篩選出的胚胎干細胞被重新注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)，使其重新發(fā)育為一個完整的胚胎。(5)產(chǎn)出的嵌合體小鼠通過雜交，最終獲得穩(wěn)定整合外源基因的純合體轉基因小鼠。胚胎干細胞植入法1995年，我國分離出小鼠胚胎干細胞；1996年，

Campbell等克隆綿羊所使用的胚胎細胞培養(yǎng)系類似于胚胎干細胞；1999年，Vogel獲得了完全由胚胎干細胞發(fā)育來的克隆小鼠；中國：將人體體細胞的細胞核放入去核的兔卵母細胞，讓融合后的細胞發(fā)育到胚泡階段，得到胚胎干細胞？優(yōu)點：囊胚腔易于注射，整合效率高，可達50％；缺點：建立胚胎干細胞系比較困難。一般毒性研究模型致突變檢測模型致癌檢測模型可發(fā)光轉基因動物模型4.轉基因動物應用與分類（1）一般毒性研究模型金屬硫蛋白(MT)基因的轉基因和基因敲除小鼠：金屬和某些非金屬的研究。MT轉基因小鼠：抗鎘毒性抗性增強；MT基因敲除小鼠：對鎘、銀、汞、四氯化碳等的毒性敏感性增強（2）致突變檢測模型

轉基因動物可確定靶器官以及對誘發(fā)的遺傳改變做精細分析等。轉基因動物是目前研究體內(nèi)基因突變唯一可行而有效的系統(tǒng)。1989年，Gosen等建立第一個以lacZ基因作為誘變靶基因的轉基因突變檢測模型，并應用于體內(nèi)基因突變研究和化學物質(zhì)的遺傳毒性分析-----所攜帶的靶基因以λ噬菌體為載體趨勢：制備以質(zhì)粒為載體的轉基因動物致突變檢測模型

phage(+galoperon)細菌藍色

用含乳糖操縱子的噬菌體培育一種轉基因動物，當噬菌體在體內(nèi)由于受化學物的處理而受到損害，不能抄錄正常的半乳糖苷水解酶，這種噬菌體在體外裝配后，其感染細菌的菌落為無色。因此根據(jù)藍色和無色菌落的多少，來判斷某些化學物基因毒性的強弱。以λ噬菌體為載體的轉基因突變檢測模型原理（3）致癌檢測模型過量表達癌基因的轉基因動物模型基因敲除動物致癌檢測模型用于生殖毒性研究轉基因動物①過量表達癌基因的轉基因動物模型TG，AC小鼠，HK-fos轉基因小鼠，ras-H2轉基因小鼠，攜帶激活的H-ras原癌基因小鼠，攜帶激活的Pin-1腫瘤基因小鼠等，對化學致癌劑敏感性增強很多倍。②基因敲除動物致癌檢測模型用同源重組的方法，將一段DNA整合到目的基因，使該基因不能表達具有正常功能的蛋白質(zhì)，用這種方法培養(yǎng)的動物稱基因敲除動物?；蚯贸齽游颬53(+/-)和正常動物P53(+/+)：致癌劑二硝基二甲胺處理，P53(+/-)平均壽命29周，P53(+/+)的平均壽命42周，其腫瘤的發(fā)生與分布也有很大的差異。③用于生殖毒性研究轉基因動物ZP3基因敲除小鼠、雌激素受體基因或孕酮受體基因敲除小鼠、DNA甲基轉移酶基因敲除小鼠等。（4）可發(fā)光轉基因動物模型

原理：將熒光素酶基因整合到細胞，微生物，或?qū)嶒瀯游锷希敓晒馑孛富虮磉_時，在有底物熒光素存在的情況下，會產(chǎn)生生物發(fā)光現(xiàn)象。利用高靈敏度CCD和軟件系統(tǒng)可對這些光學信息進行采集和分析，從而獲取生物體內(nèi)的基因表達、疾病發(fā)展，新藥的藥效等信息?；铙w成像系統(tǒng)原理

將熒光素酶基因連接于啟動子下游，穩(wěn)定整合到細胞染色體內(nèi)，使熒光素酶得到持續(xù)表達。體內(nèi)表達外源注入底物活躍細胞體內(nèi)發(fā)光全球首例轉基因克隆兔研究策略先從一種特殊水母中提取綠色熒光蛋白基因，然后經(jīng)過物理、化學處理，把該基因轉染到培養(yǎng)的兔成纖維細胞中，再挑選出發(fā)綠色熒光的轉基因體細胞，將其細胞核移植到成熟的去核兔卵母細胞中，最終構成了轉基因胚胎。胚胎經(jīng)過手術，移植入“代孕兔”體內(nèi)。經(jīng)過30天的發(fā)育，剖腹產(chǎn)獲得轉基因克隆兔。特點：為研究人員提供觀察實驗動物體內(nèi)發(fā)生的生物學現(xiàn)象的窗口，使在分子水平上實時跟蹤生物學過程成為可能。應用：廣泛應用于多個醫(yī)學研究領域，如藥理,藥效,藥物代謝，安全性/毒性評價，給藥方式等。農(nóng)業(yè)研究領域：遺傳育種、人類疾病模型體外試驗在藥理學和毒理學中的應用

體外細胞培養(yǎng)的方法在藥理學與毒理學中的應用

體外基因重組技術在藥理學中的應用體內(nèi)試驗（invivotest）：又叫整體動物實驗，利用整體實驗動物模型提供的資料，判斷外源物及其制品和混合物對健康是否有損害作用。體外試驗（invitrotest）：利用體外的方法，如體外細胞培養(yǎng)、亞細胞組分、離體臟器灌流等，研究外源化合物的藥理與毒理機制。(一)體外試驗的目的和分類目的確定藥/毒理學性質(zhì)確定安全接觸限量探究藥/毒理學機制（二）基本原理藥/毒理學效應是外源物和/或其活性代謝產(chǎn)物在敏感性細胞上或細胞內(nèi)某一分子靶部位（如酶）作用的結果將敏感細胞或細胞的分子靶部位，在體外條件下，維持其正常功能，觀察外源物對靶部位的作用及靶部位對外源物的反應。（三）體外試驗的優(yōu)缺點優(yōu)點能控制環(huán)境因素可同時和/或反復多次采樣可排除體內(nèi)各系統(tǒng)相互干擾較為快速、簡便減少整體動物的使用，經(jīng)濟可利用人體細胞缺點體外到體內(nèi)外推的問題：如體外濃度與體內(nèi)劑量間的換算；缺乏毒理學反應的調(diào)控因素：不同細胞間的相互影響、細胞與組織的修復等；難以預測慢性毒性：缺乏體外試驗的理論依據(jù)，長期生理狀態(tài)難以維持。（四）體外試驗系統(tǒng)臟器灌流：肝臟灌流、腸灌流臟器切片：肝、腎、腦、心等原代細胞培養(yǎng)：肝細胞、巨噬細胞、淋巴細胞傳代細胞（細胞系）培養(yǎng)：腎細胞、胚胎細胞組織勻漿：對細胞酶系統(tǒng)的毒理作用研究亞細胞組分：微粒體、線粒體（五）體外細胞培養(yǎng)1.常用細胞（系）：

細胞系（CellLine），原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功,細胞系可泛指一般可能傳代的細胞。其中能夠連續(xù)傳代的細胞叫做連續(xù)細胞系或無限細胞系，不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細胞系。大多數(shù)二倍體細胞為有限細胞系。細胞株（CellStrain），通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標志物的培養(yǎng)物，細胞株是用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質(zhì)或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。各種物種的成纖維細胞系：如V79中國倉鼠卵巢細胞（CHO）：由Puck在1957年建立的細胞株HeLa細胞系：1951年從一位名叫HenriettaLacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養(yǎng)而成其它細胞：淋巴（母）細胞、脂肪細胞、肝細胞、神經(jīng)細胞等。2.培養(yǎng)細胞的鑒定目的觀察培養(yǎng)有無變化，以決定是否終止培養(yǎng)觀察培養(yǎng)條件變化對培養(yǎng)細胞的影響鑒定內(nèi)容污染鑒定：真菌、細菌或支原體污染生存鑒定：臺盼藍排斥試驗、酶漏檢試驗、MTT法測細胞相對數(shù)和相對活力細胞性質(zhì)：形態(tài)、生長特性、染色體等形態(tài)學成纖維樣細胞單層培養(yǎng)時，長度＞2倍寬度上皮樣細胞多角形淋巴樣細胞圓形生長特性克隆效率測定由單個細胞生長的克隆接種效率克隆數(shù)目/植入細胞數(shù)目×100％

其他染色體結構和數(shù)目、DNA、RNA、蛋白質(zhì)含量測定3.應注意的問題細胞類型的選擇：一般藥/毒理研究應用細胞系，但代謝機理研究多不用細胞系，P450酶活性代謝活化：加肝S9，與原代細胞混合培養(yǎng)等受試物給與：有機溶劑濃度應低于0.1％設立陽性對照組：如環(huán)磷酰胺

毒性指標的選擇：IC50、細胞膜損傷、大分子合成與降解的速度、代謝能力、形態(tài)學觀察IC50：經(jīng)3天培養(yǎng)后，引起生長速率減至對照組一半時所需受試物的濃度。生長速率可用蛋白總濃度來表示

細胞膜損傷：臺盼藍攝取、胞漿酶漏出、Ca2+的釋放、鈣泵的變化等指標大分子合成與降解的改變：選用[14C]亮氨酸蛋白試驗和[3H]尿嘧啶摻入RNA試驗等指標代謝能力：可選擇ATP濃度、NADP／NADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指標，還可選擇毒物代謝酶的活性、細胞膜脂質(zhì)過氧化作用及[14C]-葡萄糖氧化代謝成14CO2的速率形態(tài)學觀察：通過光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，了解受試物對培養(yǎng)細胞的形態(tài)改變情況。4.細胞培養(yǎng)在毒理學中的應用一般毒性急性細胞毒性器官特異性毒性毒作用機理生物轉化、毒性代謝產(chǎn)物的形成遺傳毒性程序外DNA合成測定繁殖毒性比較毒性、光敏毒性本身有毒的化合物：

核苷酸同位素標記法b.

本身無毒，代謝后有毒的化合物：

在細胞培養(yǎng)液中加入肝細胞抽提液以幫助代謝毒物；或用少量原代細胞與被檢的傳代細胞混合培養(yǎng)，由引入的原代細胞提供代謝酶。如：化學物的基因毒性研究

c.建立細胞株：能合成某種單一的酶，有針對性地研究毒物的毒性作用。把轉錄某種代謝酶的DNA連接到基因載體上(多為質(zhì)粒或病毒)，通過一定的方式引入到體外培養(yǎng)細胞，利用細胞的轉錄因子，表達這種特異的酶。

人CYP1A1，2A6，2E1，3A4等，已成功引入人淋巴樣細胞株、鼠胎盤細胞株、倉鼠肝癌細胞株等，靈敏度高。如:硝基二甲基胺的毒性檢測,2A6(+)細胞≧500×2A6(-)細胞株（敏感性）和2E1（＋）細胞株（500倍）硝基二甲基胺要代謝以后才能顯示毒性；2A6是能將硝基二甲基胺轉化為毒性代謝物的代謝