聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

(PolymeraseChainReaction,PCR)

目的了解DNA特異性片段體外擴(kuò)增的基本原理，掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基本操作方法?；驹碓谀０?、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。基本步驟

1.變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂?/p>

2.退火：降溫使引物和互補(bǔ)模板在局部形成雜交鏈

3.延伸：耐熱DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物為起始點(diǎn)的延伸反應(yīng)加熱或在堿性條件下可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為DNA變性。去掉變性條件后，單鏈DNA可以重新結(jié)合，再形成雙鏈，稱之為DNA復(fù)性，又叫退火。PCR反應(yīng)中退火指引物與模板的結(jié)合。退火溫度太高,不能很好地復(fù)性太低,產(chǎn)生非特異性復(fù)性退火溫度通常比理論熔解溫度低3-5℃DNA雙鏈解離一半時(shí)的溫度稱為熔解溫度(Tm)。PCR引物的設(shè)計(jì)

1.引物設(shè)計(jì)的原則

2.引物設(shè)計(jì)的方法

（一）PCR引物設(shè)計(jì)原則1、引物長(zhǎng)度一般為15~30個(gè)核苷酸。引物過(guò)短會(huì)使PCR的特異性降低，過(guò)長(zhǎng)會(huì)提高相應(yīng)的退火溫度，并使延伸溫度超過(guò)TaqDNA聚合酶的最適溫度74℃,亦會(huì)影響產(chǎn)物的生成，且合成引物的成本增加。2、引物中的堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤，嘧啶的堆積現(xiàn)象。尤其是引物的3′端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G和C。否則會(huì)使引物在模板的G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤配對(duì)。引物中G+C的含量在45~55%左右。設(shè)計(jì)引物時(shí)要考慮3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。3、引物自身內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。按經(jīng)驗(yàn)，引物自身存在的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般不超過(guò)3bp。4、兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊。5、引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。尤其是引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。6、引物3′端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA配對(duì)。引物3′端的最佳堿基選擇是G和C。因?yàn)樗鼈冃纬傻膲A基配對(duì)比較穩(wěn)定。7、引物的5′端可以修飾，如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)。

Primer5Oligo6（二）引物設(shè)計(jì)的方法PCR反應(yīng)五要素1模板2引物3酶4dNTP5bufferPCR反應(yīng)成分1.PCR反應(yīng)的緩沖液：①10~50mmol/LTris-Cl

緩沖液，72℃時(shí)pH7.2,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，使TaqDNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。②50mmol/L的KCl可促進(jìn)引物退火，大于此濃度將會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的活性。③鎂離子濃度：1.5mmol/L

TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+

濃度過(guò)低，會(huì)顯著降低酶活性。Mg2+濃度過(guò)高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。2.dNTPs

濃度：20~200μmol/L

dNTP濃度高可加快反應(yīng)速度，同時(shí)還可增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和實(shí)驗(yàn)成本。反之，低濃度的dNTP會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降，但可提高反應(yīng)的特異性及實(shí)驗(yàn)的精確性。3.耐熱DNA聚合酶：0.5~5u

在PCR反應(yīng)中，DNA聚合酶是最關(guān)鍵的因素之一。PCR發(fā)明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它們因?qū)岬姆€(wěn)定性差而未得到廣泛應(yīng)用。直到耐熱的DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)應(yīng)用于PCR反應(yīng)，才使這一技術(shù)得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。4.引物：0.1~0.5μmol/L

PCR反應(yīng)引物濃度為0.1~0.5μmol/L。如此過(guò)量的引物才能確保模板DNA一旦變性就與引物退火，而不能與其自身退火。但引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的幾率，降低擴(kuò)增效率。但如果該比例太低，PCR效率也會(huì)降低。

5.模板在一定范圍內(nèi)PCR產(chǎn)量隨模板濃度的升高而顯著升高，但模