免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日一.體外抗原抗體反應(yīng)的特征

1.高度特異性抗原的表位與抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)。

2.可見(jiàn)性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后能肉眼直接觀察。二.抗原抗體反應(yīng)的影響因素

1.溫度：最適溫度為37℃。

2.酸堿度：最適pH=6-8。

3.電解質(zhì)：可促進(jìn)抗原與抗體的結(jié)合。常用生理鹽水。第二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日抗原抗體比例對(duì)反應(yīng)現(xiàn)象的影響第三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日三.檢測(cè)抗原和抗體的體外試驗(yàn)（一）凝集反應(yīng)

顆粒性抗原（RBC、細(xì)菌等）與相應(yīng)抗體結(jié)合形成肉眼可見(jiàn)凝集物的現(xiàn)象或反應(yīng)。

1．直接凝集試驗(yàn)（1）玻片凝集試驗(yàn)：用于定性測(cè)抗原。如ABO血型鑒定，細(xì)菌的鑒定、分型等。（2）試管凝集試驗(yàn)：用于定量測(cè)抗體如肥達(dá)氏反應(yīng)。

2．間接凝集試驗(yàn)如類風(fēng)濕因子的測(cè)定等。第四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日第五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（二）沉淀反應(yīng)

可溶性抗原（血清蛋白、組織浸液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合而形成可見(jiàn)沉淀物的反應(yīng)。因該類反應(yīng)多在半固體瓊脂凝膠中進(jìn)行，故又稱為瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或免疫擴(kuò)散。

第六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日1．單向免疫擴(kuò)散用于定量測(cè)抗原。如檢測(cè)血清免疫球蛋白、C3等含量。

第七頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日2．雙向免疫擴(kuò)散主要用于定性檢測(cè)抗原或抗體，抗原組成及兩種抗原相關(guān)性分析。第八頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日3．免疫電泳

其方法是先電泳、后擴(kuò)散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于診斷如骨髓瘤、性聯(lián)低丙種球蛋白血癥等的診斷。

第九頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日

4．免疫比濁用于定量測(cè)抗原。該法快速、簡(jiǎn)便。5）免疫比濁法

在一定量的抗體中分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時(shí)間后形成免疫復(fù)合物。用濁度計(jì)測(cè)量反應(yīng)液體的濁度，復(fù)合物形成越多，濁度越高，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)反應(yīng)液體的濁度，推算樣品中的抗原含量。第十頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（三）免疫標(biāo)記技術(shù)

用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。標(biāo)記物質(zhì)與抗體（或抗原）的化學(xué)連接未改變抗體（或抗原）的免疫學(xué)特性，且極大的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對(duì)微量物質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位檢測(cè)。免疫標(biāo)記技術(shù)主要有三種基本類型：

免疫熒光技術(shù)免疫酶技術(shù)同位素標(biāo)記技術(shù)

第十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日1．免疫熒光技術(shù)(ImmunofluorescenceTechnique)

用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待測(cè)標(biāo)本的抗原反應(yīng)，，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光，借此對(duì)標(biāo)本中的抗原作鑒定和定位。

（1）常用熒光素異硫氰酸熒光素（FITC），顯黃綠色。藻紅蛋白（PE），顯紅色。（2）方法*直接熒光法：

優(yōu)點(diǎn)--特異性強(qiáng)缺點(diǎn)--每檢測(cè)一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。*間接熒光法優(yōu)點(diǎn)--敏感性比直接法高，且制備一種熒光素標(biāo)記的二抗可用于多種抗原的檢測(cè)，缺點(diǎn)--非特異性熒光增加。第十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日第十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日第十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日2．酶免疫測(cè)定（EnzymeImmunoassay,

EIA）用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。EIA將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過(guò)酶作用于底物后顯色來(lái)判定結(jié)果。其檢測(cè)的敏感度可達(dá)pg-ng/ml水平。

Ab+EAbE

Ag+AbEAgAbE+底物

呈色反應(yīng)第十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日EIA第十六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（1）標(biāo)記的酶：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）。（2）常用方法:A酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)

將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。用洗滌法將液相中游離成分洗除.

用于可溶性抗原和抗體的檢測(cè)。

第十七頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日*

間接法：用于檢測(cè)抗體第十八頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日*

雙抗體夾心法：用于檢測(cè)抗原。第十九頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日B免疫組化技術(shù)—檢測(cè)組織中或細(xì)胞表面的抗原。

對(duì)抗原進(jìn)行定性、定量、定位檢測(cè)。

C酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）

可用于細(xì)胞因子的檢測(cè)第二十頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日3．放射免疫測(cè)定法（RIA）

敏感度可達(dá)pg水平，其標(biāo)記物為125I、131I等。常用于微量物質(zhì)的檢測(cè)，如激素、IgE等。

第二十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日4．化學(xué)發(fā)光免疫分析

該法是將發(fā)光物吖啶酯、或魯米諾標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行的結(jié)合反應(yīng)。

發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)發(fā)射出光子，用自動(dòng)發(fā)光分析儀能接收光信號(hào)，測(cè)定光子的產(chǎn)量，以反映待檢樣品中抗體或抗原的含量。其靈敏度高于RIA，常用于超微量物質(zhì)的測(cè)定，如甲狀腺素等。第二十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日5．免疫印跡法（Westernblotting）該法是將凝膠電泳與固相免疫相接合的檢測(cè)技術(shù)，即將電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫技術(shù)測(cè)定。常用于檢測(cè)多種病毒的