光譜分析四熒光分析法第一頁，共二十三頁，2022年，8月28日2

第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法一、概述

1、熒光光度分析法由激發(fā)態(tài)能級回到基態(tài)能級的過程中以光的形式放出多余的能量，并發(fā)射出比原波長更長的光譜，這一過程稱分子發(fā)光，檢測分子發(fā)射光譜的分析方法稱為熒光光度分析法。第二頁，共二十三頁，2022年，8月28日第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法一、概述2、熒光分析特點專一性強靈敏度高選擇性強發(fā)光發(fā)式多可分析參數(shù)多返回

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第三頁，共二十三頁，2022年，8月28日4

第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法二、分子發(fā)光的理論較高電子激發(fā)態(tài)振動能級以熱和無輻射的形式釋放能量最低第一級電子激發(fā)態(tài)振動能級以光子的形式釋放能量基態(tài)分子能量吸收過程λ磷光熒光發(fā)射熒光和磷光的示意圖第四頁，共二十三頁，2022年，8月28日5

常見的光致發(fā)光現(xiàn)象是熒光和磷光熒光和磷光的主要區(qū)別:

①熒光:激發(fā)光停止照射后，發(fā)光過程持續(xù)10-9-10-6s

磷光:發(fā)光過程持續(xù)10-4-10s②熒光是從最低單線激發(fā)態(tài)發(fā)出，磷光則由最低三重態(tài)能級發(fā)出。

二、分子發(fā)光的理論第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第五頁，共二十三頁，2022年，8月28日耗能方式

①在同一能級中分子間的相互碰撞消耗能量；②無輻射衰減轉給周圍分子變成振動消耗；③輻射熒光——以光子的形式釋放能量；④光分解消耗分子內部的能量。6

第六頁，共二十三頁，2022年，8月28日分子熒光的類型物理發(fā)光指熒光分子吸收了光能而產(chǎn)生的熒光，稱為物理發(fā)光。也稱光致熒光。化學發(fā)光是指分子與分子之間的化學反應所產(chǎn)生的化學能，在化學反應過程中釋放能量而發(fā)射熒光。也稱化學熒光。生物發(fā)光通過生物體內的熒光酶與熒光物質相互作用，在生物化學反應過程中所釋放出來的光能。也稱生物熒光。7

第七頁，共二十三頁，2022年，8月28日8

激發(fā)光譜:固定測量波長為熒光（或磷光）最大發(fā)射波長，然后改變激發(fā)波長，以激發(fā)光波長為橫座標，熒光強度為縱座標作圖，即可繪制。發(fā)射光譜:固定激發(fā)光波長為其最大激發(fā)波長，然后測定不同的波長時所發(fā)射的熒光或磷光強度，將熒光的光波長為橫座標，熒光強度為縱座標作圖便可得到熒光光譜第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第八頁，共二十三頁，2022年，8月28日發(fā)射光源激發(fā)光源激發(fā)光譜波長發(fā)射光譜波長熒光分子激發(fā)光源激發(fā)光譜波長發(fā)射光譜波長熒光分子發(fā)射光源(改變波長)選擇最大發(fā)射波長固定波長(改變波長)激發(fā)光譜測試示意圖發(fā)射光譜測試示意圖9

第九頁，共二十三頁，2022年，8月28日10

第十頁，共二十三頁，2022年，8月28日11

熒光量子產(chǎn)率φ分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件：

a分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應的結構，才能吸收激發(fā)光提供輻射能；b分子吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子的能力。產(chǎn)生熒光量子的強弱可以用熒光產(chǎn)率φ表示。它是熒光分子發(fā)射熒光的能為參數(shù)。（也稱熒光效率或量子效率)。

第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日12

熒光過程的量子效率φf:

如kf>>kc和kx，φf→1。如kc或kx>>kf，則φf→

0。kf——熒光發(fā)射的速度常數(shù)；kc和kx——為其它有關速度常數(shù)的總和。第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第十二頁，共二十三頁，2022年，8月28日13

對低濃度溶液樣品，保持一定最大發(fā)射波長和最大激發(fā)波長條件下測得熒光強度If可表示為：If=2.303I0

bcI0——為激發(fā)光強度；b——

為液池厚度；C——

為濃度；——摩爾吸光系數(shù)在一定條件下：If=Kc

熒光強度與熒光物質的濃度成之正比

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第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第十三頁，共二十三頁，2022年，8月28日14

熒光猝滅（熒光熄滅）：

廣義的說，指任何可使物質熒光強度下降的作用，任何可使熒光強度不與熒光物質的濃度呈線性關系的作用，或任何可使熒光量子產(chǎn)率降低的作用。狹義的說，指熒光分子與溶劑分子或溶質分子之間所發(fā)生的導致熒光強度下降的物理或化學作用過程。熒光猝滅劑：與熒光物質分子發(fā)生相互作用而引起熒光強度下降的物質，稱-。第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第十四頁，共二十三頁，2022年，8月28日15

三、熒光分析儀器第一章第二節(jié)熒光分析法光源激發(fā)單色器樣品池吸收光譜檢測器熒光分光光度示意紫外分光光度示意第十五頁，共二十三頁，2022年，8月28日熒光分光光度計根據(jù)發(fā)射光譜的特點設計的紫外分光光度計是根據(jù)吸收光譜設計的,二者差異主要有：測光角度不同單色器位置不同比色杯不同熒光檢測器與入射光源方向成90角，對面為暗背景。紫外的檢測器位置與入射光源平行。熒光計的單色器設在檢測器前面，樣品的發(fā)射光經(jīng)單色器分光后進入檢測器。紫外計單色器設在樣品池前面。熒光計使用的是四面透光的樣池，紫外計使用的是兩面透光的樣池16

第十六頁，共二十三頁，2022年，8月28日儀器名稱：日立850型熒光分光光度計儀器型號：日立850儀器名稱：PerkinElmerLS50B型發(fā)

光光譜儀儀器型號：LS50B主要技術指標：

波長范圍：200-850nm；

波長精度：±1.2nm，發(fā)射狹縫：

2.5-20nm

狹縫范圍：激發(fā)狹縫：2.5-15nm；

發(fā)射濾光片：290,350,390,430,

530nm（通過計算機選

擇），樣品池：1cm

熒光池信噪比：62：1水拉曼峰測定，

狹縫10nm）主要技術指標：

波長范圍：200-900nm；

波長精度：±1.0nm；分辨率：

￡0.15nm

狹縫范圍：0.15-20nm

信噪比：20：1（水拉曼峰測定，

狹縫5nm）

發(fā)射濾光片：290,350,390,430,

530nm（通過計算機選

擇）樣品池：1cm熒光池第十七頁，共二十三頁，2022年，8月28日基本功能：

(1)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜；

(2)ms級發(fā)光壽命測定；

(3)熒光、磷光測定；

(4)液體、固體樣品測定第十八頁，共二十三頁，2022年，8月28日19

激發(fā)光源——

作用：提供連續(xù)輻射，激發(fā)樣品要求：光源（I0）強度足夠；強度與波長無關種類：汞弧燈、氫燈或氙燈。激發(fā)單色器----

作用：置于光源和樣品之間的為激發(fā)單色器或第一單色器,篩選出特定的激發(fā)光源。

第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第十九頁，共二十三頁，2022年，8月28日20

樣品池——用石英制成，形狀:正方形、長方形、圓形的。低溫測定時在石英液槽外套一個盛放液氮的透明石英真空瓶。發(fā)射單色器——用于選擇投射到檢測器的熒光波長。檢測器——熒光或磷光的強度較弱，要求檢測器靈敏度高。

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第一章光譜分析

第二節(jié)熒光分析法第二十頁，共二十三頁，2022年，8月28日四、分析方法1、定量分析①標準曲線法同紫外可見光度計的標準曲線法②內標法在一定濃度范圍內，選擇一個標準樣品濃度，測得值與同樣條件下的未知樣品值進行比較未知樣品濃度（mg/mL）=（A1/A2）×CA1——未知樣品的熒光發(fā)光值A2——標準樣品的熒光發(fā)光值C——標準樣品濃度21

第二