基因操作第七章GeneManipulating*1基因操作第七章GeneManipulating*1*2第七節(jié)基因操作在醫(yī)學發(fā)展中的意義TheSignificanceofGeneManipulatinginMedicalDevelapments江黎明2012年10月*2第七節(jié)基因操作在醫(yī)學發(fā)展中的意義TheSignific基因操作技術在醫(yī)學方面的價值主要包括：（1）疾病相關基因和疾病分子機制的分析家；（5）高效率、低成本地生產用于疾病防治的生物

活性蛋白質、細胞、器官。（2）建立新的疾病診斷方法--基因診斷；（4）糾正人類基因缺陷的方法--基因治療；（3）發(fā)展出新的法醫(yī)學鑒定方法--法醫(yī)學鑒定；*3基因操作技術在醫(yī)學方面的價值主要包括：（1）疾病相關基因和*4一、疾病相關基因分析要確認某一疾病的相關基因，就是利用不同的方法將各種基因確定到染色體的實際位置上，并分析基因的結構和疾病狀態(tài)下基因的突變。

1911年Wilson將紅綠色盲基因首次定位到X染色體上，開創(chuàng)了人類基因定位的先河。

1968年Donahue利用系譜分析將Duffy血型基因定位于1號染色體上，這是人類首次將基因定位于常染色體上。*4一、疾病相關基因分析要確認某一疾病的相關基因，就*5

20世紀80年代以前，可進行結構分析的疾病相關基因僅限于個別功能異常非常明確，基因表達產物純化較易的遺傳性疾病，尤其是血液系統(tǒng)疾病如鐮刀狀貧血、地中海貧血等。

20世紀80年代中期以后，隨著分子生物學技術的發(fā)展，尤其是重組DNA技術水平的提高和PCR技術的廣泛應用，使疾病相關基因的鑒定與克隆工作得以迅速發(fā)展。*520世紀80年代以前，可進行結構分析的疾病相關基*6（一）功能性克隆(functionalcloning)——從對一種致病基因的功能理解出發(fā)，克隆該致病基因。實際上是利用純化蛋白克隆致病基因。獲得純化蛋白后的基因克隆方式有兩種：獲取部分氨基酸序列，推導出mRNA序列，合成

寡核苷酸探針，篩選cDNA文庫；從基因組文庫

獲取其基因組序列。

制備特異性抗體，篩選表達型cDNA文庫。只要能獲得部分氨基酸序列就可以進行基因克隆。*6（一）功能性克隆(functionalcloning)*7根據mRNA表達差異來克隆疾病相關基因：（1）削減雜交(subtractivehybridization)（2）差異顯示（differentialdisplay）PCR（3）基于PCR的削減雜交法將正常與異常的同一組織的mRNA或cDNA文庫進行雜交，篩選出表達有差異的克??；能很靈敏地擴增兩個mRNA樣品中有差異的片段，克隆后進行分析；將前兩種方法結合起來，克服了削減雜交靈敏度低，差異顯示PCR假陽性高的缺點。*7根據mRNA表達差異來克隆疾病相關基因：（1）削減雜交(*8缺點：大多數癥狀的生理、生化變化很復雜，對與之有關的蛋白質了解甚少，對其基因表達主要組織也知之不多。不同組織甚或至于同一組織的蛋白質與mRNA的“正?！辈町惡茈y與特異性差異區(qū)別。功能性克隆技術成熟、方法直接、費用較低，迄今仍是克隆基因的首選策略。優(yōu)點：*8缺點：大多數癥狀的生理、生化變化很復雜，對與之有*9（二）定位克隆（positionalcloning）——從一種致病基因的染色體定位出發(fā)，逐步縮小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆包含：遺傳學分析：分子生物學分析：包括交換分析和連鎖不平衡分析以確定致病基因的染色體定位；包括染色體異常（缺失、易位等）分析和基因文庫的篩選與基因克隆。*9（二）定位克?。╬ositionalcloning）—*10杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)致病基因的克?。菏紫?，遺傳學的家族連鎖分析確定了致病基因位于Xp21（性染色體X短臂第2區(qū)第1條帶）。將病人的Xp21DNA與正常人的雜交，從而減掉了相同的基因序列，最后剩余的序列即為病人缺失的基因。*10杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)致病基因的克?。菏紫?11新的技術非定位候選基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)：定位候選基因克隆策略

(positionalcandidategeneapproaches)：直接根據分子病理學變化和基因組作圖中各種基因產物功能的了解預測出候選致病基因。一旦致病基因的染色體定位得以確認，可以利用因特網上的基因網站所提供的基因序列數據鑒定出候選致病基因。*11新的技術非定位候選基因克隆策略定位候選基因克隆策略*12（三）基因結構和產物功能的分析——利用對于某基因結構和功能的理解，分析其與疾病的關系、是否有突變、突變產物的致病機制。獲得未知基因后可進一步進行下列工作：1．克隆和分析全長cDNA序列：根據cDNA序列推出該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列；2．克隆基因全序列：分析存在的內含子，啟動子以及其調節(jié)位點，探討基因表達調控方式；3．確定基因在的位置和拷貝數：染色體中定位多用原位雜交法，拷貝數可用Southern雜交法確定。*12（三）基因結構和產物功能的分析——利用對于某基因結構和*134．基因表達譜分析：該基因在不同組織、細胞的表達狀態(tài)。Northernblotting和點陣雜交檢測mRNA的水平。Westernblotting檢測蛋白質的表達。5．基因表達產物的功能分析：（1）找已知功能的同源蛋白或同源結構域。（2）在細胞內過量表達該基因，觀察各種功能影響。（3）在細胞內抑制該基因表達，分析細胞功能變化；

建立基因剔除小鼠，分析基因產物功能。（4）分析與該基因產物相互作用分子，或者是相互

作用的蛋白分子或核酸。*134．基因表達譜分析：該基因在不同組織、細胞的表達狀態(tài)。*14二、制造生物活性蛋白基因工程技術的發(fā)展在醫(yī)學上最重要的成就表現在治療用生物活性蛋白或疫苗的生產和使用。通過基因的克隆，可獲得具有特定生物學活性的蛋白質。這尤其適用于那些來源特別有限的蛋白質，或自然界本不存在的蛋白質。克隆基因的表達可在大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳類細胞或整體動物體內。*14二、制造生物活性蛋白基因工程技術的發(fā)展在醫(yī)學上*15生物安全性：活性的可控性：資源和生產成本：未發(fā)現諸有如此類豬胰島素、牛腦垂體提取的生長激素、人血VIII因子的副作用。基因工程產品的可重復性要好于生物提取物。無資源依賴性，生產成本也明顯低于生物提取?；蚬こ坍a品比生物提取產品有明顯的優(yōu)勢：*15生物安全性：活性的可控性：資源和生產成本：未發(fā)產品名稱適應癥乙型肝炎表面抗原人胰島素生長激素組織肝淳蛋白激活物（TPA）α-干擾素β-干擾素γ-干擾素促紅細胞生成素（EPO）*粒細胞刺激因子（GSF）粒細胞-巨噬細胞刺激因子（GMSF）*表皮生長因子（EGF）第VIII因子第IX因子白細胞介素2（IL-2）白細胞介素3（IL-3）白細胞介素4（IL-4）干細胞生長因子（SCF）抗CD3抗體CAMPATH-1H（淋巴細胞抗體）抗內毒素抗體抗腫瘤壞死因子抗體注射疫苗用于預防乙型肝炎糖尿病垂體功能低下急性心肌梗塞慢性髓系白血病，骨髓瘤乙型肝炎，艾滋病人并發(fā)kaposis肉瘤多發(fā)性硬化（試用）抗貧血*腎性貧血化療后白細胞和內體骨髓移植再生*嚴重燒傷血友病A，B血友病A，B腫瘤免疫治療化療后促進髓母細胞形成免疫缺陷病，腫瘤，免疫佐劑骨髓移植前擴增骨髓干細胞器官移植類風濕性關節(jié)炎，非何杰金氏淋巴瘤革蘭氏陽性菌感染嚴重炎癥，類風濕性關節(jié)炎表7-1臨床正在使用或試用的部分基因工程產品*16產品名稱適應癥乙型肝炎表面抗原注射疫苗用于預防乙型肝炎表7-載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定核酸分子雜交法*17（一）重組DNA技術載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA是在編碼蛋白質基因的特定位置引入堿基替代、產生小的堿基缺失或插入，使其編碼的蛋白質的一級結構發(fā)生改變。在合成PCR引物時，除了在定點誘變的位置引入相應的突變（點突變、小片段插入或缺失）外，其余序列與模板完全配對

PCR擴增后，產物中就引入特定的突變；將PCR產物克隆表達，可獲得定點突變的蛋白質。PCR誘變：*181.蛋白質工程中的定點誘變技術是在編碼蛋白質基因的特定位置引入堿基替代、產生小的堿

表達體系的建立包括表達載體的構建、受體細胞的建立和表達產物的分離、純化等技術和策略。

外源基因表達涉及目的基因的克隆、復制、轉錄、翻譯、蛋白質產物的加工及分離純化等過程，需要在適合的表達系統(tǒng)中完成。表達系統(tǒng)可根據受體細胞的不同分為原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)。*192.目的基因體外表達表達體系的建立包括表達載體的構建、受體細胞的建立和表真核表達載體—大多是穿梭載體含有原核克隆載體的復制子、抗性篩選基因和MCS等序列；含有真核細胞的啟動子、增強子、剪接信號、轉錄終止信號和PolyA化信號及遺傳選擇標記等組件。*20原核表達載體含有強啟動子及其兩側的調控序列，SD序列，帶有轉錄終止序列含有原核克隆載體的復制子、抗性篩選基因和MCS等序列；真核表達載體—大多是穿梭載體含有原核克隆載體的復制子、抗性篩（1）目的基因在原核系統(tǒng)中的表達大腸桿菌（E.coli）表達體系最常用優(yōu)點是培養(yǎng)方法簡單、迅速、經濟而又適合大規(guī)模生產。*21（1）目的基因在原核系統(tǒng)中的表達大腸桿菌（E.coli）表達在真核細胞中表達外源基因的體系主要有酵母、昆蟲細胞（桿狀病毒）、哺乳動物和高等植物。*22（2）目的基因在真核細胞中的表達瞬時表達（不與宿主染色體整合）常用的瞬時表達宿主是來源于非洲綠猴腎CV-1細胞的COS細胞。穩(wěn)定表達（整合至宿主染色體中）常用的穩(wěn)定表達宿主細胞是來源于中國倉鼠卵巢的CHO細胞。在真核細胞中表達外源基因的體系主要有酵母、昆蟲細胞（*23（二）轉基因技術簡介轉基因技術(transgenictechnique)利用DNA重組技術在動物體內引入可遺傳給子代的外源基因的技術。轉基因(transgene)：被導入的目的基因MicroinjectionintothePronucleusofaBovineZygote轉基因動物(transgenicanimal)：目的基因的受體動物*23（二）轉基因技術簡介轉基因技術(transgenic基本原理

采用基因轉移技術將目的基因導入受精卵的細胞核內或著床前的胚胎干細胞，然后將細胞導入受體動物子宮，使之發(fā)育成個體。

*24基因的導入方式：顯微注射法(最常用)胚胎干細胞法逆轉錄病毒感染法基本原理*24基因的導入方式：顯微注射法(最常用)*25顯微注射是最早發(fā)展，也是最為有效的外源

基因導入方法。將目的基因直接注射到受精卵內，目的基因即可與

受精卵的染色體整合，最終可產生帶有外源基因的

轉基因動物。轉基因動物發(fā)育后，在其體細胞和生殖細胞中都有

外源基因的存在和表達，并可將該基因遺傳給子代。可以在攜帶外源基因的載體內加上組織特異性啟動

子，從而在轉基因動物體內限定表達外源基因的組

織和器官。*25顯微注射是最早發(fā)展，也是最為有效的外源將目的基因直接注顯微注射法建立轉基因鼠技術路線目的基因供體動物受精卵受體動物輸卵管動物幼崽轉基因動物微注射移植妊娠出生分子檢測*26顯微注射法建立轉基因鼠技術路線目的基因供體動物受精卵受體動物1982年哈佛R.D.Palmiter“制造”的“超級小鼠”其中有七只帶有融合基因，六只生長迅速，每只體重平均可達44g，為同窩無融合基因小鼠平均體重29g的1.5倍。把這種重組的質粒注射入小鼠受精卵中，經過充分發(fā)育后分娩出了21小鼠。將大鼠生長激素基因與小鼠金屬硫蛋白基因的啟動子順序連接，再引入質粒中。轉基因小鼠正常小鼠*271982年哈佛R.D.Palmiter“制造”的“超級小鼠”2000年法國科學家“制造”出發(fā)出綠色熒光的兔子“Alba”。改造水母的熒光蛋白基因使熒光蛋白發(fā)光率提高了2倍，再將該基因顯微注射轉入到兔子的受精卵中，由此培養(yǎng)出了會發(fā)光的兔子Alba。在普通光線下它看上去與其它同類沒有區(qū)別，但在較暗光線下它的身體就會放射出奇異的綠光。*282000年法國科學家“制造”出發(fā)出綠色熒光的兔子“Alba”乳腺生物反應器的誕生

據推測，2010年世界上采用動物乳腺生物反應器生產的年產超過了500億美元。

1987年Gordon等將組織型纖溶酶原激活劑(tPA)與小鼠乳清蛋白基因的啟動子構成重組基因，培育出了37只在乳汁中能表達tPA的轉基因小鼠。*29乳腺生物反應器的誕生據推測，2010年世界上采用動物動物多肽藥物用途綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫綿羊CFTR治療囊腫性纖維化綿羊組織型纖溶酶原活化因子治療血栓綿羊凝血VIII因子、IX因子治療血友病綿羊纖維蛋白原傷口愈合豬組織型纖溶酶原活化因子治療血栓豬凝血VIII因子、IX因子治療血友病山羊人蛋白質C治療血栓山羊抗血栓因子3治療血栓山羊谷氨酸脫羧酶治療I型糖尿病山羊Pro542治療愛滋病牛a-乳清白蛋白抗炎癥牛凝血VIII因子治療血友病牛纖維蛋白原傷口愈合牛膠原蛋白I,II組織修復,治療風濕性關節(jié)炎牛乳鐵蛋白治療腸道感染,感染性關節(jié)炎牛人血清白蛋白維護血液體積雞,牛,山羊單克隆抗體用于疫苗生產*30動物多肽藥物用途綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫綿羊CFTR治*31*31顯微注射法等傳統(tǒng)的轉基因技術具有隨機性和不可預見性、整合率、表達低等式缺陷。外源基因的拷貝數和整合位點都是隨機的；小鼠,大鼠,兔,牛,豬,綿羊陽性率分別為26%、44%、15%、0.7%、0.9%、0.9%。

整合率極低，得到的轉基因動物數量更少。采用非受精卵還出現嵌合體；受到宿主染色體上整合位點的影響，大部分轉

基因表達水平較低。*32顯微注射法等傳統(tǒng)的轉基因技術具有隨機性和不可預見性、整合率、

即體細胞克隆技術，是用顯微操作、電融合等方法將動物體細胞的細胞核全部導入另一個個體的去除細胞核的卵細胞內，使之發(fā)育成為個體。*33

核轉移技術可使一個細胞變成一個個體，所產生的個體攜帶的遺傳物質與細胞核供體的遺傳物質完全一樣，是一種無性繁殖過程，即克隆(clone)。（三）核轉移技術簡介即體細胞克隆技術，是用顯微操作、電融合等方法*341.動物克隆——轉移的核末經修飾*341.動物克隆——轉移的核末經修飾*35*35*36多利羊誕生于1996年7月5日，1997年首次向公眾披露。被美國《科學》雜志評為1997年世界十大科技進步的第一項，也是當年最引人注目的國際新聞之一?？茖W家認為，“多利”的誕生標志著生物技術新時代的來臨。1997年2月27日《Nature》報道，維爾穆特(Wilmut)和坎貝爾(Campbell)利用克隆技術培育出一只小母羊。*36多利羊誕生于1996年7月5日，1997年首次向公眾披*37坎貝爾利用克隆多利時冷凍保存下來的，同一只母羊乳腺組織樣本，克隆出“多利四羊組”。*37坎貝爾利用克隆多利時冷凍保存下來的，同一只母羊轉基因動物可以作為天然的生物工廠，合成多肽和蛋白質等生物活性物質，制備藥物、抗體和疫苗等，稱為動物生物反應器(animalbioreactor)。生物藥物生產主要通過乳腺生產(動物乳腺生物反應器)，少數通過腎臟和膀胱。用于表達的生物反應器包括動物血液、泌尿系統(tǒng)、精囊腺、乳腺等，還包括禽蛋和昆蟲（例如家蠶）個體等。2.轉基因動物生物反應器的制備—轉移的核經過修飾*38轉基因動物可以作為天然的生物工廠，合成多肽和蛋白質等*391997年6月伊恩·維爾穆特(Wilmut)報道用基因改造過的胎兒成纖維細胞為核供體，獲得了表達人凝血因子IX的轉基因克隆綿羊“波莉”。成功克隆出攜帶有人凝血因子ＩX基因的綿羊早期

胚胎成纖維細胞；以該細胞系為核供體移植到去核卵母細胞中，經

過處理后將卵母細胞植入假孕綿羊體內發(fā)育。獲得3只能高水平表達人凝血因子ＩX（125μg/ml）

的綿羊。*391997年6月伊恩·維爾穆特(Wilmut)報道用基因

人體移植器官短缺是一個世界性難題，研究人員把目光移向動物以尋求可替代移植器官。

豬器官的體積、形狀和DNA基本與人類相似，是理想的器官供應者，但這種器官移植的主要問題之一是免疫排斥。三、制造用于移植的細胞、組織和器官*40人體移植器官短缺是一個世界性難題，研究人員把目光移向解決辦法之一：通過轉基因技術，特別是基因打靶技術：敲除α-半乳糖抗原決定基因，再結合克隆技術，培育大量不含免疫排斥的轉基因克隆豬的器官。向供體器官基因組敲入某種調節(jié)因子，抑制α-半乳糖抗原決定基因的表達；*41解決辦法之一：通過轉基因技術，特別是基因打靶技術：敲除α-半*42（一）基因打靶技術簡介可在細胞水平進行，從而建立新的細胞系；也可在動物整體水平進行，以建立基因剔除動物。

基因打靶(Genetargeting)，是一種在胚胎干細胞(ES)技術和同源重組技術的基礎之上，定向改變生物體內某種基因的技術。基因敲除(geneknockout)：定向敲除某種基因基因敲入(geneknockin)：定向替代某種基因*42（一）基因打靶技術簡介可在細胞水平進行，從而建*43基本過程包括：①用同源基因片段構建含有目的基因的載體；②用顯微注射法將含有目的基因的載體導入ES細胞，

與ES細胞染色體的相應基因發(fā)生同源重組，替代ES細胞中原有的基因；③將基因替代了的ES細胞注入動物的囊胚中，使其

與囊胚中的細胞共同組成囊胚內的細胞團；④將囊胚移植到假孕動物的子宮中，使之發(fā)育成一

種既有含目的基因細胞又有原有細胞的嵌合體；⑤將嵌合體動物與正常動物交配，最終篩選出基因替代的純合子動物。*43基本過程包括：①用同源基因片段構建含有目的基因的載體跨物種感染：一般不會感染人的病毒，通過異種器官移植提供的種間細胞親密接觸，可能感染人或者與人的病毒重組形成更危險更致命的病毒，而且免疫系統(tǒng)受到抑制的移植受體比一般人更容易被感染。更加重要的是，轉基因動物帶的未知病毒是否會從移植受體擴散出去，從而傳播到其他人造成疫病大流行，引起流行??？風險*44跨物種感染：一般不會感染人的病毒，通過異種器官移植提組織工程

是利用人體自身細胞和組織工程的理論與方法，使原先缺損的組織和器官沿著設計好的支架、模型順其自然地成長起來發(fā)。*45多能干細胞的定向分化組織工程是利用人體自身細胞和組織工程的理論與方法，使2006年，京都大學的山中伸彌(ShinyaYamanaka)從24個候基因中篩選出4個與胚胎干細胞多能性更為密切相關的基因：Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4；證實了分化的細胞可以通過少數幾個因子的外源導入而被重編程到具有多能性的狀態(tài)。將它們導入到小鼠胚胎成纖維細胞和鼠尾成纖維細胞，成功地將其重編程為具有胚胎干細胞多能性的細胞，稱之為誘導多能干細胞(inducedpluripotentstemcell,iPScell)

。（二）誘導產生的多功能性干細胞技術*462006年，京都大學的山中伸彌(ShinyaYam1.Oct3/4Oct-4，也稱Oct-3，屬于POU轉錄因子家族的一員。是哺乳動物胚胎發(fā)育的一個關鍵的調控因子。是全能性的標志；能夠促使ICM形成、維持胚胎干細胞未分化前狀態(tài)，并促進其增殖。*471.Oct3/4Oct-4，也稱Oct-3，屬于POU轉錄2.SOX2基因SOX2基因是編碼轉錄因子的主控基因（mastergenes）家族的一個成員。轉錄因子是些與DNA結合并調節(jié)其他基因表達的蛋白質。*482.SOX2基因SOX2基因是編碼轉錄因子的主控基因3.癌癥基因c-MYC癌癥基因c-MYC，是一種最容易過渡表現于人類的致癌基因，它對某些成體干細胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES細胞的分化。*493.癌癥基因c-MYC癌癥基因c-MYC，是一種最4.Klf4Krueppel-likefactor4，KLF4上皮鋅指轉錄因子Klf4(舊稱GKLF)

調節(jié)體外細胞的增生與分化。*504.Klf4Krueppel-likefactor誘導式多能性干細胞實驗流程式*51誘導式多能性干細胞實驗流程式*51制定治療用iPS實驗流程*52制定治療用iPS實驗流程*52

2006年11月20日，日本京都大學的山中伸彌(ShinyaYamanaka)在《Cell》雜志上發(fā)表重量級論文，宣布他們用基因改造的手段，將人類體細胞改造成了類胚胎干細胞，其功能上幾乎可以和胚胎干細胞相媲美。*532006年11月20日，日本京都大學的山中伸彌(Sh

同是2007年11月20日，美國威斯康星大學詹姆斯·湯姆森的研究小組在《Science》雜志發(fā)表體細胞轉變成“誘導性多能干細胞”(iPS細胞)的成果。*54同是2007年11月20日，美國威斯康星大學詹姆斯·JunyingYU,…JamesA.Thomson.InducedPluripotentStemCellLinesDerivedfromHumanSomaticCells.Science,2007,318(5858):1917-1920這位在美國研究的中國科學家俞君英博士，出生于浙江諸暨，1997年畢業(yè)于北京大學，赴美國美國賓夕法尼亞大學留學。2003年進威斯康星大學詹姆斯·湯姆森實驗室進行研究工作。*55JunyingYU,…JamesA.Thomson.*562012年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎京都大學物質-細胞統(tǒng)合系統(tǒng)據點iPS細胞研究中心主任山中伸彌、英國發(fā)育生物學家約翰-戈登因在細胞核重新編程研究領域的杰出貢獻而獲獎。所謂細胞核重編程即將成年體細胞重新誘導回早期干細胞狀態(tài)，以用于形成各種類型的細胞，應用于臨床醫(yī)學。*562012年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎京都大學物質-細*57山中伸彌簡介：山中伸彌，1962年出生于日本大阪府，日本醫(yī)學家，誘導多功能干細胞(iPScell)創(chuàng)始人之一。京都大學再生醫(yī)科研究所干細胞生物系教授，美國加利福尼亞州舊金山心血管疾病研究所高級研究員。約翰-戈登簡介：約翰-伯特蘭-戈登，79歲，1933年10月2日出生，英國發(fā)育生物學家。他主要以在細胞核移植與克隆方面的先驅性研究而知名。2009年戈登與日本醫(yī)學家山中伸彌一同獲得拉斯克基礎醫(yī)學獎，2012年與山中伸彌一同獲諾貝爾獎生理學或醫(yī)學獎。*57山中伸彌簡介：約翰-戈登簡介：*582.簡述顯微注射法建立轉基因鼠技術路線。思考題：3.

簡述獲得2012年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎的誘導式多能性干細胞技術的原理？1.基因操作技術在醫(yī)學方面的應用主要包括？*582.簡述顯微注射法建立轉基因鼠技術路線。思考題后面內容直接刪除就行資料可以編輯修改使用資料可以編輯修改使用資料僅供參考，實際情況實際分析后面內容直接刪除就行主要經營：課件設計，文檔制作，網絡軟件設計、圖文設計制作、發(fā)布廣告等秉著以優(yōu)質的服務對待每一位客戶，做到讓客戶滿意！致力于數據挖掘，合同簡歷、論文寫作、PPT設計、計劃書、策劃案、學習課件、各類模板等方方面面，打造全網一站式需求主要經營：課件設計，文檔制作，網絡軟件設計、圖文設計制作、發(fā)感謝您的觀看和下載Theusercandemonstrateonaprojectororcomputer,orprintthepresentationandmakeitintoafilmtobeusedinawiderfield感謝您的觀看和下載Theusercandemonstr基因操作第七章GeneManipulating*62基因操作第七章GeneManipulating*1*63第七節(jié)基因操作在醫(yī)學發(fā)展中的意義TheSignificanceofGeneManipulatinginMedicalDevelapments江黎明2012年10月*2第七節(jié)基因操作在醫(yī)學發(fā)展中的意義TheSignific基因操作技術在醫(yī)學方面的價值主要包括：（1）疾病相關基因和疾病分子機制的分析家；（5）高效率、低成本地生產用于疾病防治的生物

活性蛋白質、細胞、器官。（2）建立新的疾病診斷方法--基因診斷；（4）糾正人類基因缺陷的方法--基因治療；（3）發(fā)展出新的法醫(yī)學鑒定方法--法醫(yī)學鑒定；*64基因操作技術在醫(yī)學方面的價值主要包括：（1）疾病相關基因和*65一、疾病相關基因分析要確認某一疾病的相關基因，就是利用不同的方法將各種基因確定到染色體的實際位置上，并分析基因的結構和疾病狀態(tài)下基因的突變。

1911年Wilson將紅綠色盲基因首次定位到X染色體上，開創(chuàng)了人類基因定位的先河。

1968年Donahue利用系譜分析將Duffy血型基因定位于1號染色體上，這是人類首次將基因定位于常染色體上。*4一、疾病相關基因分析要確認某一疾病的相關基因，就*66

20世紀80年代以前，可進行結構分析的疾病相關基因僅限于個別功能異常非常明確，基因表達產物純化較易的遺傳性疾病，尤其是血液系統(tǒng)疾病如鐮刀狀貧血、地中海貧血等。

20世紀80年代中期以后，隨著分子生物學技術的發(fā)展，尤其是重組DNA技術水平的提高和PCR技術的廣泛應用，使疾病相關基因的鑒定與克隆工作得以迅速發(fā)展。*520世紀80年代以前，可進行結構分析的疾病相關基*67（一）功能性克隆(functionalcloning)——從對一種致病基因的功能理解出發(fā)，克隆該致病基因。實際上是利用純化蛋白克隆致病基因。獲得純化蛋白后的基因克隆方式有兩種：獲取部分氨基酸序列，推導出mRNA序列，合成

寡核苷酸探針，篩選cDNA文庫；從基因組文庫

獲取其基因組序列。

制備特異性抗體，篩選表達型cDNA文庫。只要能獲得部分氨基酸序列就可以進行基因克隆。*6（一）功能性克隆(functionalcloning)*68根據mRNA表達差異來克隆疾病相關基因：（1）削減雜交(subtractivehybridization)（2）差異顯示（differentialdisplay）PCR（3）基于PCR的削減雜交法將正常與異常的同一組織的mRNA或cDNA文庫進行雜交，篩選出表達有差異的克?。荒芎莒`敏地擴增兩個mRNA樣品中有差異的片段，克隆后進行分析；將前兩種方法結合起來，克服了削減雜交靈敏度低，差異顯示PCR假陽性高的缺點。*7根據mRNA表達差異來克隆疾病相關基因：（1）削減雜交(*69缺點：大多數癥狀的生理、生化變化很復雜，對與之有關的蛋白質了解甚少，對其基因表達主要組織也知之不多。不同組織甚或至于同一組織的蛋白質與mRNA的“正?！辈町惡茈y與特異性差異區(qū)別。功能性克隆技術成熟、方法直接、費用較低，迄今仍是克隆基因的首選策略。優(yōu)點：*8缺點：大多數癥狀的生理、生化變化很復雜，對與之有*70（二）定位克?。╬ositionalcloning）——從一種致病基因的染色體定位出發(fā)，逐步縮小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆包含：遺傳學分析：分子生物學分析：包括交換分析和連鎖不平衡分析以確定致病基因的染色體定位；包括染色體異常（缺失、易位等）分析和基因文庫的篩選與基因克隆。*9（二）定位克?。╬ositionalcloning）—*71杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)致病基因的克隆：首先，遺傳學的家族連鎖分析確定了致病基因位于Xp21（性染色體X短臂第2區(qū)第1條帶）。將病人的Xp21DNA與正常人的雜交，從而減掉了相同的基因序列，最后剩余的序列即為病人缺失的基因。*10杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)致病基因的克?。菏紫?72新的技術非定位候選基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)：定位候選基因克隆策略

(positionalcandidategeneapproaches)：直接根據分子病理學變化和基因組作圖中各種基因產物功能的了解預測出候選致病基因。一旦致病基因的染色體定位得以確認，可以利用因特網上的基因網站所提供的基因序列數據鑒定出候選致病基因。*11新的技術非定位候選基因克隆策略定位候選基因克隆策略*73（三）基因結構和產物功能的分析——利用對于某基因結構和功能的理解，分析其與疾病的關系、是否有突變、突變產物的致病機制。獲得未知基因后可進一步進行下列工作：1．克隆和分析全長cDNA序列：根據cDNA序列推出該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列；2．克隆基因全序列：分析存在的內含子，啟動子以及其調節(jié)位點，探討基因表達調控方式；3．確定基因在的位置和拷貝數：染色體中定位多用原位雜交法，拷貝數可用Southern雜交法確定。*12（三）基因結構和產物功能的分析——利用對于某基因結構和*744．基因表達譜分析：該基因在不同組織、細胞的表達狀態(tài)。Northernblotting和點陣雜交檢測mRNA的水平。Westernblotting檢測蛋白質的表達。5．基因表達產物的功能分析：（1）找已知功能的同源蛋白或同源結構域。（2）在細胞內過量表達該基因，觀察各種功能影響。（3）在細胞內抑制該基因表達，分析細胞功能變化；

建立基因剔除小鼠，分析基因產物功能。（4）分析與該基因產物相互作用分子，或者是相互

作用的蛋白分子或核酸。*134．基因表達譜分析：該基因在不同組織、細胞的表達狀態(tài)。*75二、制造生物活性蛋白基因工程技術的發(fā)展在醫(yī)學上最重要的成就表現在治療用生物活性蛋白或疫苗的生產和使用。通過基因的克隆，可獲得具有特定生物學活性的蛋白質。這尤其適用于那些來源特別有限的蛋白質，或自然界本不存在的蛋白質?？寺』虻谋磉_可在大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳類細胞或整體動物體內。*14二、制造生物活性蛋白基因工程技術的發(fā)展在醫(yī)學上*76生物安全性：活性的可控性：資源和生產成本：未發(fā)現諸有如此類豬胰島素、牛腦垂體提取的生長激素、人血VIII因子的副作用。基因工程產品的可重復性要好于生物提取物。無資源依賴性，生產成本也明顯低于生物提取。基因工程產品比生物提取產品有明顯的優(yōu)勢：*15生物安全性：活性的可控性：資源和生產成本：未發(fā)產品名稱適應癥乙型肝炎表面抗原人胰島素生長激素組織肝淳蛋白激活物（TPA）α-干擾素β-干擾素γ-干擾素促紅細胞生成素（EPO）*粒細胞刺激因子（GSF）粒細胞-巨噬細胞刺激因子（GMSF）*表皮生長因子（EGF）第VIII因子第IX因子白細胞介素2（IL-2）白細胞介素3（IL-3）白細胞介素4（IL-4）干細胞生長因子（SCF）抗CD3抗體CAMPATH-1H（淋巴細胞抗體）抗內毒素抗體抗腫瘤壞死因子抗體注射疫苗用于預防乙型肝炎糖尿病垂體功能低下急性心肌梗塞慢性髓系白血病，骨髓瘤乙型肝炎，艾滋病人并發(fā)kaposis肉瘤多發(fā)性硬化（試用）抗貧血*腎性貧血化療后白細胞和內體骨髓移植再生*嚴重燒傷血友病A，B血友病A，B腫瘤免疫治療化療后促進髓母細胞形成免疫缺陷病，腫瘤，免疫佐劑骨髓移植前擴增骨髓干細胞器官移植類風濕性關節(jié)炎，非何杰金氏淋巴瘤革蘭氏陽性菌感染嚴重炎癥，類風濕性關節(jié)炎表7-1臨床正在使用或試用的部分基因工程產品*77產品名稱適應癥乙型肝炎表面抗原注射疫苗用于預防乙型肝炎表7-載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定核酸分子雜交法*78（一）重組DNA技術載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA是在編碼蛋白質基因的特定位置引入堿基替代、產生小的堿基缺失或插入，使其編碼的蛋白質的一級結構發(fā)生改變。在合成PCR引物時，除了在定點誘變的位置引入相應的突變（點突變、小片段插入或缺失）外，其余序列與模板完全配對

PCR擴增后，產物中就引入特定的突變；將PCR產物克隆表達，可獲得定點突變的蛋白質。PCR誘變：*791.蛋白質工程中的定點誘變技術是在編碼蛋白質基因的特定位置引入堿基替代、產生小的堿

表達體系的建立包括表達載體的構建、受體細胞的建立和表達產物的分離、純化等技術和策略。

外源基因表達涉及目的基因的克隆、復制、轉錄、翻譯、蛋白質產物的加工及分離純化等過程，需要在適合的表達系統(tǒng)中完成。表達系統(tǒng)可根據受體細胞的不同分為原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)。*802.目的基因體外表達表達體系的建立包括表達載體的構建、受體細胞的建立和表真核表達載體—大多是穿梭載體含有原核克隆載體的復制子、抗性篩選基因和MCS等序列；含有真核細胞的啟動子、增強子、剪接信號、轉錄終止信號和PolyA化信號及遺傳選擇標記等組件。*81原核表達載體含有強啟動子及其兩側的調控序列，SD序列，帶有轉錄終止序列含有原核克隆載體的復制子、抗性篩選基因和MCS等序列；真核表達載體—大多是穿梭載體含有原核克隆載體的復制子、抗性篩（1）目的基因在原核系統(tǒng)中的表達大腸桿菌（E.coli）表達體系最常用優(yōu)點是培養(yǎng)方法簡單、迅速、經濟而又適合大規(guī)模生產。*82（1）目的基因在原核系統(tǒng)中的表達大腸桿菌（E.coli）表達在真核細胞中表達外源基因的體系主要有酵母、昆蟲細胞（桿狀病毒）、哺乳動物和高等植物。*83（2）目的基因在真核細胞中的表達瞬時表達（不與宿主染色體整合）常用的瞬時表達宿主是來源于非洲綠猴腎CV-1細胞的COS細胞。穩(wěn)定表達（整合至宿主染色體中）常用的穩(wěn)定表達宿主細胞是來源于中國倉鼠卵巢的CHO細胞。在真核細胞中表達外源基因的體系主要有酵母、昆蟲細胞（*84（二）轉基因技術簡介轉基因技術(transgenictechnique)利用DNA重組技術在動物體內引入可遺傳給子代的外源基因的技術。轉基因(transgene)：被導入的目的基因MicroinjectionintothePronucleusofaBovineZygote轉基因動物(transgenicanimal)：目的基因的受體動物*23（二）轉基因技術簡介轉基因技術(transgenic基本原理

采用基因轉移技術將目的基因導入受精卵的細胞核內或著床前的胚胎干細胞，然后將細胞導入受體動物子宮，使之發(fā)育成個體。

*85基因的導入方式：顯微注射法(最常用)胚胎干細胞法逆轉錄病毒感染法基本原理*24基因的導入方式：顯微注射法(最常用)*86顯微注射是最早發(fā)展，也是最為有效的外源

基因導入方法。將目的基因直接注射到受精卵內，目的基因即可與

受精卵的染色體整合，最終可產生帶有外源基因的

轉基因動物。轉基因動物發(fā)育后，在其體細胞和生殖細胞中都有

外源基因的存在和表達，并可將該基因遺傳給子代。可以在攜帶外源基因的載體內加上組織特異性啟動

子，從而在轉基因動物體內限定表達外源基因的組

織和器官。*25顯微注射是最早發(fā)展，也是最為有效的外源將目的基因直接注顯微注射法建立轉基因鼠技術路線目的基因供體動物受精卵受體動物輸卵管動物幼崽轉基因動物微注射移植妊娠出生分子檢測*87顯微注射法建立轉基因鼠技術路線目的基因供體動物受精卵受體動物1982年哈佛R.D.Palmiter“制造”的“超級小鼠”其中有七只帶有融合基因，六只生長迅速，每只體重平均可達44g，為同窩無融合基因小鼠平均體重29g的1.5倍。把這種重組的質粒注射入小鼠受精卵中，經過充分發(fā)育后分娩出了21小鼠。將大鼠生長激素基因與小鼠金屬硫蛋白基因的啟動子順序連接，再引入質粒中。轉基因小鼠正常小鼠*881982年哈佛R.D.Palmiter“制造”的“超級小鼠”2000年法國科學家“制造”出發(fā)出綠色熒光的兔子“Alba”。改造水母的熒光蛋白基因使熒光蛋白發(fā)光率提高了2倍，再將該基因顯微注射轉入到兔子的受精卵中，由此培養(yǎng)出了會發(fā)光的兔子Alba。在普通光線下它看上去與其它同類沒有區(qū)別，但在較暗光線下它的身體就會放射出奇異的綠光。*892000年法國科學家“制造”出發(fā)出綠色熒光的兔子“Alba”乳腺生物反應器的誕生

據推測，2010年世界上采用動物乳腺生物反應器生產的年產超過了500億美元。

1987年Gordon等將組織型纖溶酶原激活劑(tPA)與小鼠乳清蛋白基因的啟動子構成重組基因，培育出了37只在乳汁中能表達tPA的轉基因小鼠。*90乳腺生物反應器的誕生據推測，2010年世界上采用動物動物多肽藥物用途綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫綿羊CFTR治療囊腫性纖維化綿羊組織型纖溶酶原活化因子治療血栓綿羊凝血VIII因子、IX因子治療血友病綿羊纖維蛋白原傷口愈合豬組織型纖溶酶原活化因子治療血栓豬凝血VIII因子、IX因子治療血友病山羊人蛋白質C治療血栓山羊抗血栓因子3治療血栓山羊谷氨酸脫羧酶治療I型糖尿病山羊Pro542治療愛滋病牛a-乳清白蛋白抗炎癥牛凝血VIII因子治療血友病牛纖維蛋白原傷口愈合牛膠原蛋白I,II組織修復,治療風濕性關節(jié)炎牛乳鐵蛋白治療腸道感染,感染性關節(jié)炎牛人血清白蛋白維護血液體積雞,牛,山羊單克隆抗體用于疫苗生產*91動物多肽藥物用途綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫綿羊CFTR治*92*31顯微注射法等傳統(tǒng)的轉基因技術具有隨機性和不可預見性、整合率、表達低等式缺陷。外源基因的拷貝數和整合位點都是隨機的；小鼠,大鼠,兔,牛,豬,綿羊陽性率分別為26%、44%、15%、0.7%、0.9%、0.9%。

整合率極低，得到的轉基因動物數量更少。采用非受精卵還出現嵌合體；受到宿主染色體上整合位點的影響，大部分轉

基因表達水平較低。*93顯微注射法等傳統(tǒng)的轉基因技術具有隨機性和不可預見性、整合率、

即體細胞克隆技術，是用顯微操作、電融合等方法將動物體細胞的細胞核全部導入另一個個體的去除細胞核的卵細胞內，使之發(fā)育成為個體。*94

核轉移技術可使一個細胞變成一個個體，所產生的個體攜帶的遺傳物質與細胞核供體的遺傳物質完全一樣，是一種無性繁殖過程，即克隆(clone)。（三）核轉移技術簡介即體細胞克隆技術，是用顯微操作、電融合等方法*951.動物克隆——轉移的核末經修飾*341.動物克隆——轉移的核末經修飾*96*35*97多利羊誕生于1996年7月5日，1997年首次向公眾披露。被美國《科學》雜志評為1997年世界十大科技進步的第一項，也是當年最引人注目的國際新聞之一?？茖W家認為，“多利”的誕生標志著生物技術新時代的來臨。1997年2月27日《Nature》報道，維爾穆特(Wilmut)和坎貝爾(Campbell)利用克隆技術培育出一只小母羊。*36多利羊誕生于1996年7月5日，1997年首次向公眾披*98坎貝爾利用克隆多利時冷凍保存下來的，同一只母羊乳腺組織樣本，克隆出“多利四羊組”。*37坎貝爾利用克隆多利時冷凍保存下來的，同一只母羊轉基因動物可以作為天然的生物工廠，合成多肽和蛋白質等生物活性物質，制備藥物、抗體和疫苗等，稱為動物生物反應器(animalbioreactor)。生物藥物生產主要通過乳腺生產(動物乳腺生物反應器)，少數通過腎臟和膀胱。用于表達的生物反應器包括動物血液、泌尿系統(tǒng)、精囊腺、乳腺等，還包括禽蛋和昆蟲（例如家蠶）個體等。2.轉基因動物生物反應器的制備—轉移的核經過修飾*99轉基因動物可以作為天然的生物工廠，合成多肽和蛋白質等*1001997年6月伊恩·維爾穆特(Wilmut)報道用基因改造過的胎兒成纖維細胞為核供體，獲得了表達人凝血因子IX的轉基因克隆綿羊“波莉”。成功克隆出攜帶有人凝血因子ＩX基因的綿羊早期

胚胎成纖維細胞；以該細胞系為核供體移植到去核卵母細胞中，經

過處理后將卵母細胞植入假孕綿羊體內發(fā)育。獲得3只能高水平表達人凝血因子ＩX（125μg/ml）

的綿羊。*391997年6月伊恩·維爾穆特(Wilmut)報道用基因

人體移植器官短缺是一個世界性難題，研究人員把目光移向動物以尋求可替代移植器官。

豬器官的體積、形狀和DNA基本與人類相似，是理想的器官供應者，但這種器官移植的主要問題之一是免疫排斥。三、制造用于移植的細胞、組織和器官*101人體移植器官短缺是一個世界性難題，研究人員把目光移向解決辦法之一：通過轉基因技術，特別是基因打靶技術：敲除α-半乳糖抗原決定基因，再結合克隆技術，培育大量不含免疫排斥的轉基因克隆豬的器官。向供體器官基因組敲入某種調節(jié)因子，抑制α-半乳糖抗原決定基因的表達；*102解決辦法之一：通過轉基因技術，特別是基因打靶技術：敲除α-半*103（一）基因打靶技術簡介可在細胞水平進行，從而建立新的細胞系；也可在動物整體水平進行，以建立基因剔除動物。

基因打靶(Genetargeting)，是一種在胚胎干細胞(ES)技術和同源重組技術的基礎之上，定向改變生物體內某種基因的技術?；蚯贸?geneknockout)：定向敲除某種基因基因敲入(geneknockin)：定向替代某種基因*42（一）基因打靶技術簡介可在細胞水平進行，從而建*104基本過程包括：①用同源基因片段構建含有目的基因的載體；②用顯微注射法將含有目的基因的載體導入ES細胞，

與ES細胞染色體的相應基因發(fā)生同源重組，替代ES細胞中原有的基因；③將基因替代了的ES細胞注入動物的囊胚中，使其

與囊胚中的細胞共同組成囊胚內的細胞團；④將囊胚移植到假孕動物的子宮中，使之發(fā)育成一

種既有含目的基因細胞又有原有細胞的嵌合體；⑤將嵌合體動物與正常動物交配，最終篩選出基因替代的純合子動物。*43基本過程包括：①用同源基因片段構建含有目的基因的載體跨物種感染：一般不會感染人的病毒，通過異種器官移植提供的種間細胞親密接觸，可能感染人或者與人的病毒重組形成更危險更致命的病毒，而且免疫系統(tǒng)受到抑制的移植受體比一般人更容易被感染。更加重要的是，轉基因動物帶的未知病毒是否會從移植受體擴散出去，從而傳播到其他人造成疫病大流行，引起流行?。匡L險*105跨物種感染：一般不會感染人的病毒，通過異種器官移植提組織工程

是利用人體自身細胞和組織工程的理論與方法，使原先缺損的組織和器官沿著設計好的支架、模型順其自然地成長起來發(fā)。*106多能干細胞的定向分化組織工程是利用人體自身細胞和組織工程的理論與方法，使2006年，京都大學的山中伸彌(ShinyaYamanaka)從24個候基因中篩選出4個與胚胎干細胞多能性更為密切相關的基因：Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4；證實了分化的細胞可以通過少數幾個因子的外源導入而被重編程到具有多能性的狀態(tài)。將它們導入到小鼠胚胎成纖維細胞和鼠尾成纖維細胞，成功地將其