..精選文檔精選文檔.精選文檔一．實驗名稱：質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化二．實驗?zāi)康模簩⒕幋a目的蛋白的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)，從而大量擴(kuò)增并表達(dá)目的蛋白三．實驗原理：轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。轉(zhuǎn)化所用的受體細(xì)胞一般是限制-修飾系統(tǒng)缺陷變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶〔R-，M-〕。將對數(shù)生長期的細(xì)菌〔受體細(xì)胞〕經(jīng)理化方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時性改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制和表達(dá)實現(xiàn)信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞具有了新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子〔帶有異源DNA分子的細(xì)胞〕四．實驗步驟;1.把固態(tài)培養(yǎng)基加熱融化，由于溫度較熱用自來水沖洗瓶身降溫〔十度左右會再凝固，所以不能沖洗太久〕，在超凈臺中參加千分子一的AP〔本質(zhì)粒具有抗AP性，故AP能抑制別的細(xì)菌生長〕，然后向平皿中倒入少許〔大約5毫升〕培養(yǎng)基，說明自己名字2.到-80℃冰箱取出質(zhì)?！裁科?00微升，可制作兩板〕迅速放入冰盤保存，放入4℃保存30min3.將上述混合物放在42℃水浴鍋中融化90s〔據(jù)經(jīng)驗42度90s最適合〕，在超凈臺中用針尖沾取少許質(zhì)粒放入大腸桿菌EP管內(nèi)〔質(zhì)粒為提純多的所以加很少，一般未提純的加1微升〕，再加200微升無抗培養(yǎng)基，加完后放回冰盤〔熱：壁通透性大，冷:通透性小，起封閉作用〕放入搖床15min。4.搖完后用微量加樣槍析出滴到制作好的培養(yǎng)皿的中央，然后慢慢鋪滿平皿底部〔千萬不能滑到邊緣，由于量比較少，滑到邊緣就不容易再鋪〕，說明細(xì)菌名稱，實驗時間，放入4℃溫箱隔夜保存5.觀察有稀疏斑點狀菌落，從4度冰箱取出培養(yǎng)基，在超凈臺中，取四支帶帽試管〔表有黃線者為抗AP〕分別倒入培養(yǎng)基至黃線處；用過火的鑷子夾取黃槍尖〔槍尖過火要快以防燒焦〕按象限沾取菌落一枚，放入試管中，注意整個過程要過火。6.將試管放入搖床中，未完待續(xù)五．實驗結(jié)果:六．本卷須知：1.培養(yǎng)基溶解后沖洗降溫不要太久以免再凝固2.取質(zhì)粒盡可能的一直放入冰盒3.42度90s4.鋪板要勻?。。　驹怼哭D(zhuǎn)化是將外源DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。轉(zhuǎn)化所用的受體細(xì)胞一般是限制-修飾系統(tǒng)缺陷變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶〔R-，M-〕。將對數(shù)生長期的細(xì)菌〔受體細(xì)胞〕經(jīng)理化方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時性改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制和表達(dá)實現(xiàn)信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞具有了新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子〔帶有異源DNA分子的細(xì)胞〕。本實驗采用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞。其原理是細(xì)胞處于0～4℃，CaCl2低滲溶液中，大腸桿菌細(xì)胞膨脹成球狀。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞外表，經(jīng)42℃90秒熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA得合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型，如氨芐青霉素耐藥〔Ampr〕得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含Amp的選擇性培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)過夜，即可獲得細(xì)菌菌落。本實驗是將人Bcl-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α擴(kuò)增菌，轉(zhuǎn)化后在含Amp的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，生長的菌落即為含重組質(zhì)粒的工程菌。含人Bcl-2重組質(zhì)粒的DH5α菌用于質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增，獲得的質(zhì)粒將作為限制性內(nèi)切酶的酶切底物DNA。【試劑與器材】1．LB液體培養(yǎng)基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高壓滅菌消毒。2．LB固體培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基中加1.5%瓊脂粉，高壓滅菌消毒，待泠卻至不燙手背時鋪培養(yǎng)皿。3．0.1mol/LCaCl2高壓滅菌消毒或過濾除菌。4．氨芐青霉素用無菌水或生理鹽水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。5．人Bcl-2重組質(zhì)粒它是EcoRⅠ單酶切的pBluescriptⅡKS(-)載體與EcoRⅠ單酶切的人Bcl-2cDNA重組而成的，大小為4861bp，前者是一種由pUC19質(zhì)粒衍生而來的具有2961bp的質(zhì)粒載體。因此用EcoRⅠ酶切那么應(yīng)到空載pBluescriptⅡKS(-)載體(2.96kb)和人Bcl-2cDNA片段(1.9kb)。配制成2g/1μl。6．大腸桿菌DH5α此為DNA擴(kuò)增菌7．恒溫水浴箱8．超凈工作臺9．高速冷凍離心機(jī)10．恒溫?fù)u床11．恒溫箱12．消毒離心管13．消毒tips14．玻璃培養(yǎng)皿直徑90mm15．玻璃涂布器16．95%乙醇17．標(biāo)記筆【操作步驟】1．細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞的制備將DH5α菌種劃線于LB瓊脂板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)過夜。次日取菌液1ml接種至含有100mlLB培養(yǎng)基的燒瓶中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至約2～3h，待A600值到達(dá)0.3～0.4時將燒瓶置于冰浴10～15min。將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個滅菌處理過的冰預(yù)冷的50ml離心管中。4000×g，4℃離心10min，棄培養(yǎng)基，將管倒置于濾紙使最后的殘留液體流盡。加預(yù)冷的已過濾除菌的0.1mol/LCaCl2重懸菌體，置冰浴30min。4000×g，4℃離心10min，棄培養(yǎng)基。再加4ml預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2，輕輕重懸菌體，置4℃冰箱12～16h。2．DNA重組子的轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α本實驗中的DNA重組子為人Bcl-2重組質(zhì)粒。在無菌條件下按每管取200μl新鮮感受態(tài)DH5α細(xì)菌置于無菌的5ml塑料離心管中，共2管，分別參加人Bcl-2重組質(zhì)粒(10ng)和消毒水(作陰性對照)各5μl，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30min。42℃，熱休克90s，中途不要搖動離心管，每管加800μl無抗生素的LB培養(yǎng)基，于37℃空氣HYPERLINK"://ebioe/yp/product-list-339.html